Vývoj a zjednotenie metód na analýzu a štandardizáciu inzulínových prípravkov pomocou vysokotlakej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

  • Diagnostika

Táto dizertačná práca by mala ísť do knižnice v blízkej budúcnosti.
Informujte o prijatí

Práca - 480 rubľov, doručenie 10 minút, nepretržite, sedem dní v týždni a sviatky.

Abstrakt - 240 rubľov, doručenie 1-3 hodiny, od 10-19 (moskovský čas), okrem nedele

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Vývoj a zjednotenie metód analýzy a štandardizácie inzulínových preparátov pomocou vysokotlakej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou (RP HPLC): disertačná práca. Kandidát farmaceutických vied: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Miesto ochrany: moskovská lekárska akadémia].- Moskva, 2005.- 139 s.: Il.

Obsah pre dizertačnú prácu

KAPITOLA 1. Preskúmanie literatúry 11

1. Úloha inzulínu pri liečbe diabetes mellitus 11

2. Biosyntéza a biologický účinok inzulínu 12

3. Všeobecné charakteristiky fyzikálno-chemických a farmaceutických vlastností inzulínu 15

4. Inzulínové prípravky 24

5. Metódy výroby, štandardizácia a kontrola kvality inzulínových prípravkov 31

6. Použitie HPLC pri farmaceutickej analýze inzulínu. 46

KAPITOLA 2. Vyhlásenie o probléme 50

KAPITOLA 3. Štúdia vplyvu rôznych faktorov na chromatografické správanie inzulínu v podmienkach RP HPLC 56

1. Metódy a materiály 57

2. Diskusia o výsledkoch 62

2.1. Vplyv zloženia tlmivého roztoku 62

2.2. Účinok koncentrácie síranu sodného 68

2.3. Vplyv teploty chromatografickej kolóny 70

2.4. Účinok organického modifikátora 75

2.5. Vplyv dĺžky alkylových radikálov naočkovanej fázy 80

2.6. Vplyv dĺžky chromatografickej kolóny 80

KAPITOLA 4. Zlepšenie farmakologických metód na analýzu inzulínových prípravkov založených na použití RP HPLC 82

1. Výber optimálnych podmienok pre chromatografické stanovenie inzulínu a jeho nečistôt v liečivých prípravkoch 82

Metrologické charakteristiky metódy 84

3. Použitie vyvinutej metodiky na testovanie úradných inzulínových prípravkov 95

KAPITOLA 5. Vývoj metód na analýzu injekčných dávkových foriem izofán-inzulínu založených na metóde PF HPLC 107

1. Voľba podmienok pre chromatografické stanovenie protamínu v dávkových formách izofánu-inzulínu 110

2. Štúdia chromatografických profilov protamínov izolovaných z rôznych druhov rýb 121

3. Metóda stanovenia protamínu v izofánno-inzulínových prípravkoch 123

4. Validácia vyvinutej metodiky 125

Všeobecné závery 136

Odkazy 139

Všeobecné charakteristiky fyzikálno-chemických a farmaceutických vlastností inzulínu

Z chemického hľadiska je inzulín malý globulárny proteín s molekulovou hmotnosťou do 6000 Da. Zároveň treba poznamenať, že inzulín je bežný názov pre celú rodinu homológnych proteínov prírodného a umelého pôvodu so spoločnou charakteristickou biologickou aktivitou. Proteínová povaha inzulínu bola stanovená v roku 1928 [52]. Jedná sa o proteíny, ktoré produkujú biuretovú reakciu a Pauliho reakciu. Štruktúra inzulínu bola úplne založená na začiatku 50. rokov. Základné chemické zloženie inzulínov rôzneho pôvodu sa vyznačuje údajmi uvedenými v tabuľke 1 [40].

Zloženie aminokyselín. Väčšina molekúl inzulínu obsahuje 51 aminokyselinových zvyškov, medzi ktorými je 17 aminokyselín vo väčšine známych proteínov.

Charakteristickým znakom aminokyselinového zloženia bovinného, ​​prasačieho a ľudského inzulínu je tryptofán a metionín. Zloženie aminokyselín týchto typov inzulínu je uvedené v tabuľke 2 [40,46].

Inhibítor všetkých druhov inzulínu je obsah cystínu (6 polo-cystínových zvyškov). Navyše inzulínová molekula všetkých typov obsahuje 6 amidových skupín (asparagín, glutamín).

Keď sa inzulín uvoľní spolu s hlavnou frakciou, môžu sa pozorovať frakcie deamidovaných foriem inzulínu. V kyslom prostredí sa v procese deamidácie postupne odštiepi všetkých šesť amidových skupín a elektroforetická a chromatografická mobilita inzulínu sa mení [40]. Tvorba deamidovaných foriem inzulínu môže byť posúdená výsledkami stanovenia amoniaku. Pre plne amidovú formu inzulínu sa stanoví 6 mol amoniaku na 1 mol proteínu, pre deamidované formy môže byť táto hodnota 5 až 0.

Primárna štruktúra inzulínu. Primárnu štruktúru inzulínu rozlúčila skupina Sanger v rokoch 1945-1955. Cez sériu chromatografických metód, ktoré sa nechajú oddeliť a identifikovať jednotlivé peptidy, aminokyseliny a ich deriváty, Sanger schopný stanoviť primárnu štruktúru hovädzieho inzulínu [130,131,132,133,134,135]. Ďalšie štúdie inzulín rôzneho pôvodu s použitím rôznych fyzikálno-chemickými metódami, vrátane spôsobu Edman na stanovenie celú aminokyselinovú sekvenciu dlhých peptidov potvrdila zistenia Senger et al inzulínovej štruktúry [bb].

Doteraz bola primárna štruktúra inzulínu určená zástupcami 24 druhov patriacich do 4 tried zvierat: cicavcov, vtákov, rýb a cyklostómov [14]. Výskum inzulínu rôzneho pôvodu pokračuje [71,72,73].

Štruktúra inzulínu u rôznych zvierat je podobná, ale nie identická. Vo svojej primárnej štruktúre je ľudský inzulín podobný ako ošípaná, pes, spermie a králičie inzulíny, ktoré sa líšia len v jednej aminokyseline [40]. Odlišuje sa od hovädzieho inzulínu tromi aminokyselinami. Vo väčšom rozsahu ľudský inzulín nie je podobný inzulínu guinejského ošípanej, vtákov a rýb [40]. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii ľudských, ošípaných a hovädzích inzulínov sú uvedené v tabuľke 3.

Napriek štrukturálnym rozdielom majú všetky typy inzulínov podobnú biologickú aktivitu, t.j. hypoglykemický účinok. Avšak hodnota vykazovala biologickú účinnosť silne závisí od druhu rastlín, a je v rozmedzí od 11 IU / mg (v Severnom mori inzulínu COD) a 62 IU / mg (inzulín morčacie a kuracie), v ktorom je činnosť ľudského inzulínu je v poriadku 25-30 IU / mg [40]. Čím sú medzidruhové rozdiely väčšie, tým väčší je rozdiel v biologickej aktivite zodpovedajúceho inzulínu.

Funkčne aktívna molekula inzulínu pozostáva z dvoch polypeptidových reťazcov (reťazcov A a B) spojených disulfidovými väzbami; jeden spoj je tvorený siedmy aminokyselinové zvyšky z dvoch reťazcov, druhý disulfidovou väzba je tvorená 20. zvyšku A-reťazca a 19. zvyšok B-reťazca (obrázok 2). Okrem toho, inzulínová molekula má tretiu disulfidovou väzbu, ktorá spája vnitrořetězcový a 6. a 11. zvyšky v reťazci [59.117].

Sekundárna štruktúra Použitie odlišné fyzikálno-chemické a fyzikálne metódy, bolo preukázané, že inzulínová molekula je charakteristické veľmi trojrozmerné štruktúry (konformácie), čo prispieva ku špecifické biologické funkcie [14]. V molekule natívneho inzulínu sú prítomné súčasne aj kryce skrutkovice a p-záhyb. Okrem toho existujú oblasti s neusporiadanou štruktúrou a štruktúrou <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Pri zahriatí sa kyslý roztok inzulínu (pH 3.2.a-5.02.) Pri teplote 100 ° C a rýchle ochladenie na -80 ° C, tzv fibrilárna inzulínu - hormónu úplne inaktívne formy [27]. Pridanie inzulínu fibrilárna vlákien do aktívneho roztoku inzulínu spôsobuje spontánny kvantitatívne vyzrážanie inzulínu vo forme fibríl [14,17].

Výrobné metódy, štandardizácia a kontrola kvality inzulínových prípravkov

Získanie druhov zvieracieho inzulínu. Priemyselná výroba hovädzieho a bravčového inzulínu bola zavedená takmer súčasne v niekoľkých krajinách, čoskoro po objavení inzulínu v roku 1921 [63]. Odvtedy zostáva koncept získania inzulínu prakticky nezmenený (tabuľka b) [17, 18]. Surovinami na výrobu živočíšnych druhov inzulínu sú pankreas z jatočného hovädzieho dobytka používaného v potravinách.

Najdôležitejšou úlohou pri výrobe inzulínu je jej čistenie - uvoľnenie látok z sprievodných nečistôt, ktoré znižujú biologickú aktivitu, čo spôsobuje imunologickú reakciu alebo potenciálne nebezpečné pre zdravie pacienta. Napríklad po niekoľkých rokoch používania zle purifikovaného inzulínu v krvi pacienta môže byť až 5 000 IU inzulínu viazaných na protilátky. Protilátky proti inzulínu významne ovplyvňujú profil jeho účinku a tým prispievajú k nestabilnému priebehu diabetu.

Prvým spôsobom čistenia inzulínu bola rekryštalizácia v prítomnosti zinočnatých solí. V roku 1945 sa ukázalo, že inzulín sedemnásobný rekryštalizácia značne znižuje alergické reakcie u pacientov, v porovnaní s úradníkom v čase inzulínových prípravkov [63].

protiprúdové extrakcie (PE), rozdeľovaču chromatografia (PX), iónovo-výmennou chromatografiou (MOV) diskelek-troforeza (DEF), a vylúčenie chromatografie na silikagélu (GEH) [63] za použitia počtu vzoriek metódy heterogenity inzulínu po kryštalizácii a jediný kryštalizácie ukazuje,

Bolo zistené, že hlavné nečistoty sú súčasne inzulín: proinzulínu, ich medziproduktov, kovalentné dimér inzulínu, monodezamidoinsulin a monoarginin monoetilinsulin, rovnako ako množstvo vysokomolekulárnych zlúčenín nie sú prirodzené inzulín. Generalizované závery štúdií, pričom do úvahy informácie o imunologické aktivity detekované nečistoty [138], záver bol potreba ďalšieho čistenia inzulínu látok, tak, že analytické metódy a DEF GEH detekovaný jednu zložku - zodpovedajúce inzulín.

Pre vyriešenie problémov v čistení inzulínu GEH 1950 spôsobe bolo navrhnuté, a v roku 1970 spôsob anionoobmennoi chromatografie (AOX). Zistilo sa, že inzulín, čistený metódou AOX, obsahuje asi 500 ppm (častí na milión) nečistôt s proinzulínovou aktivitou [137]. Ďalšie čistenie inzulínu za použitia vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie na reverznej fáze (RP HPLC) na zníženie obsahu imuno-génu frakcií pred detekčný limit [63].

Prehľad aktuálneho vývoja v oblasti chromatografického čistenia inzulínu je uvedený v [96]. Inzulín, purifikovaný postupne s použitím IOC a GEC, sa nazýva monokomponentný inzulín [63]. Získanie ľudského inzulínu. Hľadanie metód na získanie ľudského inzulínu bolo spôsobené dvomi okolnosťami. Na jednej strane, relevantnosti surovín problém v prípade produkcie zvieracieho inzulínu, na druhej strane - rýchly rozvoj vedy v tejto oblasti skutočnú príležitosť dať myšlienku do praxe. V rokoch 1979 a 1981 takmer súčasne boli vyvinuté dva spôsoby získania ľudského inzulínu - biosyntetické a polosyntetické [102, 108]. V roku 1981 sa spoločnosť Novo Nordisk po prvýkrát na svete začala sériovo vyrábať ľudský polo-syntetický inzulín. Spôsob používaný spoločnosťou je založený na enzymatickom a chemickom nahradení Al v molekule prasačeného inzulínu so zvyškom Tre [61]. Táto metóda je priamo závislá od získania požadovaného množstva prasačieho inzulínu, čo znižuje jeho ekonomickú hodnotu. Možnosť získavania ľudského inzulínu pomocou biosyntetickej metódy sa objavila pri vývoji technológie rekombinantnej DNA [10]. Práce na geneticky upravenej inzulínovej výrobe sa začali pred približne 25 rokmi. V roku 1978 bolo zistené, že bol získaný kmeň E. coli produkujúci potkanie proinsuling. V roku 1979 boli Genentechove štúdie schopné klonovať do E. coli gény kódujúce aminokyselinové sekvencie. inzulínových reťazcov A a B zahrnutých v p-halogén-tikidázovej oblasti plazmidu pBR322 [10,102]. V roku 1981 sa syntetizuje proinzulinový gén analog - mini-proinzulínu-C, kde sa 35-ulcerózna segmentu C-peptid nahradený šiestich aminokyselín: Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg a ukazuje jeho expresiu v E. coli. V roku 1982 spoločnosť Eli Lilly začala s prvou priemyselnou produkciou ľudského inzulínu na svete pomocou technológie dvoch reťazcov vyvinutého v spolupráci s Genentechom [102]. V súčasnosti sa preukázala možnosť získavania ľudského inzulínu pomocou rôznych expresných systémov [3,10,101,102]. Z hospodárskeho hľadiska je použitie geneticky modifikovaných kmeňov gram-pozitívnych baktérií E.coli, z ktorých mnohé sú považované za nadproduktory, zvlášť zaujímavé [3]. Zároveň sa dosiahol významný pokrok pri bunkách kvasiniek Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabuľka 7 uvádza hlavné, spoločné pre rôzne metódy produkcie rekombinantného ľudského inzulínu, etapy technologického procesu [3,10,63].

Aplikácia vyvinutej metodiky na testovanie oficiálnych inzulínových prípravkov

Vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC) - varianta stĺpci kvapalinová chromatografia, pričom mobilná fáza - eluent - plniace stĺpec prejde sorbentu pri vysokej rýchlosti v dôsledku značného tlaku (až 400h105 Pa) na vstupe do kolóny [11].

Ako spôsob analýzy komplexných zmesí látok sa HPLC ukázala pred viac ako 30 rokmi. Použitie sorbentov s priemerom častíc 3 až 10 μm spôsobilo prudké zvýšenie účinnosti chromatografickej separácie v porovnaní s klasickou verziou kolónovej kvapalinovej chromatografie. HPLC sa preto často označuje ako vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Inštrumentálne vlastnosti použitia HPLC sú podrobne opísané v mnohých príručkách [49.50] av príslušných častiach vedúceho liekopisu [79, 150]. Pre HPLC sa vyvinula a vyrába široká škála sorbentov. Podľa autorov prieskumu [51] približne 100 firiem na celom svete vyrába viac ako 300 druhov sorbentových názvov. História, súčasný stav a perspektívy vývoja metódy sú diskutované v prehľadoch [51] a [77.78].

V rôznych variantoch sa metóda HPLC široko používa vo farmaceutickej analýze (kontrola výroby a testovanie kvality lieku). Metóda je zahrnutá vo všetkých vedúcich liekopisoch sveta. Táto metóda je úplne opísaná v európskych a amerických liekopisoch. Na identifikáciu liekov sa používa HPLC, na určenie čistoty, frakčného zloženia molekulovej hmotnosti a kvantitatívnej analýzy. V US Pharmacopoeia 28 ed. približne 30% súkromných článkov zahŕňa použitie HPLC. V Európskom liekopise 4. vyd. toto číslo je asi 40%.

Prvou chromatografickou metódou na testovanie inzulínu bola nízkotlaková kvapalinová chromatografia (GE ZhND). Princíp separácie za podmienok HPLC je založený na rôznej schopnosti molekúl rôznych veľkostí preniknúť do pórov neutrálneho gélu, ktorý slúži ako stacionárna fáza. Hydrodynamický priemer inzulínového monoméru a diméru je úmerný ich molekulovej hmotnosti a je 2,69 a 5,50 nm [115].

V roku 1967 sa pomocou metódy GE-IHDD ukázalo, že komerčné prípravky inzulínu, čistené kryštalizáciou, obsahujú nečistoty s molekulovou hmotnosťou presahujúcou molekulovú hmotnosť inzulínu [63]. Na chromatogramech prasačieho inzulínu sa našli tri píky, bežne označované ako a-, b- a c-zložky. Odvtedy bolo navrhnuté množstvo chromatografických systémov na kontrolu obsahu nečistôt s vysokou molekulovou hmotnosťou v inzulínových prípravkoch. Separácia sa uskutočňovala na vysoko napučiavajúcich agarózových xerogéloch (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Alebo dextrán (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals). Ako IF [127] sa použili 1-3 M roztoky kyseliny octovej. Vysoká citlivosť týchto sorbentov na stláčanie pri tlakoch presahujúcich tlak napučiavania matrice spôsobuje, že tieto materiály sú nevhodné pre prevádzku v režime HPLC.

Použitie kvapalinovej chromatografie s vylúčením gélu pri vysokých tlakoch (GE HPLC) na analýzu inzulínu bolo najskôr opísané v roku 1980 po vývoji tvrdých makroporéznych sorbentov kompatibilných s vodou a odolávajúcich vysokým tlakom. V [151] Separácia sa uskutoční na stĺpci Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-gél SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) za denaturačných podmienok (7 M močoviny zmesi roztoku minerálnych kyselín alebo iónu detergenty). Potreba analýzy inzulínu pri denaturačných podmienkach je spojená so schopnosťou inzulínu agregovať v roztoku. Na oddelenie inzulínu v podmienkach vysokotlakej kvapalinovej chromatografie HPLC sa tiež opísalo použitie "tradičného" elučného činidla kyseliny octovej [152]. Použitie kyseliny octovej má niekoľko výhod - minimálny vplyv na natívnu štruktúru oddelených zlúčenín, dostupnosť, nízke náklady, navyše dôležitou skutočnosťou je schopnosť kyseliny octovej potlačiť spojenie inzulínu.

V súčasnosti je HPLC ghvd liekopisnou metódou na sledovanie obsahu nečistôt s vysokou molekulovou hmotnosťou v látkach a hotových dávkových formách. Tento spôsob sa tiež používa na stanovenie obsahu protamínu v izofánno-inzulínových prípravkoch.

Použitie HPLC na obrátených fázach (RP HPLC) na separáciu hovädzieho dobytka a prasačieho inzulínu prvý raz preukázalo vysokú účinnosť tejto metódy na analýzu inzulín podobných peptidov s podobnou štruktúrou.

Mechanizmus separácie proteínov a polypeptidov za podmienok RP HPLC je založený na rozdielnej hydrofóbnosti molekúl inzulínu a príbuzných nečistôt. K dnešnému dňu bolo opísaných niekoľko desiatok spôsobov chromatografickej separácie inzulínu rôzneho pôvodu a ich derivátov, vrátane proin-sulínu, pankreatických polypeptidov, dezamidových derivátov, diméru inzulínu. [126] ukázala možnosť oddelenia kurčiat, králikov, oviec a inzulínu koní. Ľudský, hovädzí a bravčový inzulín bol tiež oddelený. Lloyd a Corran publikovali metódu oddelenia hovädzieho, bravčového, ľudského inzulínu a zodpovedajúcich deamidovaných foriem [104].

Separácia sa uskutočňuje na modifikovaných sorbentoch silikagélu, metylových, butylových, oktylových, oktadecylových a fenylových skupinách v izokratickom alebo gradientovom móde. Ako PF sa používajú organické modifikátory - acetonitril, metylalkohol, izopropylalkohol, zmiešané s vodnými tlmivými roztokmi obsahujúcimi anorganické soli a činidlá proti iónovému paru. Peaková detekcia sa uskutočňuje hlavne spektrofotometrickou metódou pri vlnovej dĺžke 190-220 nm, sú tiež opísané fluorimetrické metódy [103].

Analýza látky a hotových dávkových foriem inzulínu pomocou RP HPLC je opísaná v súkromných článkoch v Americkom a Európskom liekopise [79, 150]. Metóda sa používa na testovanie liekov špecifikovanej skupiny z hľadiska "autenticity inzulínu", "príbuzných bielkovín", "kvantitatívnej determinácie" a "inzulínu v roztoku".

Výskumná literatúra tiež opisuje použitie iónovo-výmennej a afinitnej chromatografie na inzulínovú analýzu [44, 102], avšak tieto metódy neboli široko používané v liekopise.

Výber podmienok pre chromatografické stanovenie protamínu v dávkovacích formách izofánu-inzulínu

Zvýšené ion PF sily zvyčajne vedie k zvýšeniu súčiniteľa inzulínu kapacity, ktorá môže byť spôsobené viacerými faktormi: - koncentrácia zvýšenie iónov znižuje stupeň ionizácie nabitých skupín molekuly proteínu, čím sa zvyšuje jej hydrofóbnosti / - vysoká koncentrácia katiónu prispieva ku tienenie voľných silanolových skupín na povrchu stacionárne fáza, ktorá oslabuje nešpecifickú elektrostatickú interakciu protonovaných aminoskupín proteínu s matricou; - vysoká iónová sila ovplyvňuje priestorovú štruktúru inzulínu, v dôsledku čoho sa mení povrch dostupný interakcii so sorbentom. Koncentrácia anorganických solí v FS ovplyvňuje tvar vrcholov a selektivitu separácie inzulínu a desamido-Asn-inzulínu [143, 144]. Pri isokratická elúcie na sorbentu LiChrosorb Sіv 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 2,3), uspokojivého výsledku bolo dosiahnuté iba pridanie síranu sodného do roztoku pufru na koncentráciu 0,1 M. Väčšina techník analýzy inzulín súčasťou liekopisnej monografií a ND, použite PF na báze tlmivých roztokov s obsahom síranu sodného rovným 0,2 M. Takýto vysoký obsah síranu sodného negatívne ovplyvňuje reprodukovateľnosť výsledkov chromatografie v dôsledku stratifikácie elučných činidiel, vysoko koncentrované soľné roztoky majú negatívny vplyv na chromatografické zariadenia, čo skracuje ich životnosť. Vzhľadom na to, že liekopisné metódy analýzy boli vyvinuté pred viac ako dvadsiatimi rokmi, bolo zaujímavé študovať chromatografické správanie inzulínu pod OF-HPLC na chromatografických sorbentoch poslednej generácie v závislosti od koncentrácie síranu sodného. Súčasne sa pokúsili zistiť, či je prípustné zníženie obsahu síranu sodného v PF bez výrazného zhoršenia separačnej schopnosti chromatografického systému. V dôsledku výskumu sa zistilo, že účinok koncentrácie síranu sodného v PF je odlišný v závislosti od druhu očkovanej fázy, ako aj od druhu inzulínu. Na sorbentoch s očkovanými skupinami C4 a C selektivita oddelenia vrcholov ľudského inzulínu a desamido-Asn-ľudského inzulínu nezávisí od koncentrácie síranu sodného. roztoku pufra v rozmedzí od 0,05 M do 0,2 M. Na sorpente Diaspher-110-C18 má separačná selektivita tohto páru píkov maximálne 0,05 M a minimálne 0,1 M (graf 4). Na druhej strane selektivita separácie živočíšnych druhov inzulínu a ich zodpovedajúcich desamidovaných foriem AsnA21 nezávisí od iónovej sily roztoku, keď sa oddelí na sorbente Diaspher-110-C18. Na sorbente s roubovanými skupinami C8 sa selektivita zvyšuje z 1,25 na 1,28 s nárastom koncentrácie síranu sodného (obrázok 4). Na sorbentu vrúbľované skupiny C4 selektivity separácie v prípade hovädzieho inzulínu maximálna, keď bola zistená 0,1 M síranu sodného a minimálne na 0,2 M. Za bravčového inzulínu výrazné maximum pri koncentrácii síranu sodného 0,1 M, v tomto prípade zvýšenia iónovej sily viedli k zníženiu selektivity separácie (obrázok 4). Počet účinných teoretických platní sa zvyšuje so zvyšujúcou sa koncentráciou síranu sodného. Výnimkou je správanie ľudského inzulínu na sorbente Diasfer-110-C8 (obrázok 5). Stupeň oddelenia špičiek inzulínu a desamido-Asn-inzulínu sa zvyšuje so zvýšením iónovej sily FS, bez ohľadu na druh inzulínu a typ štepenej fázy (schéma b). Znížením koncentrácie síranu sodného z 0,2 M na 0,1 M sa stupeň oddelenia vybraného páru pikov v priemere znižuje o 5% pre ľudské a prasacie inzulíny a o 10% pre hovädzí inzulín. Vzhľadom na skutočnosť, že absolútna hodnota stupňa separácie presahuje 2,0, merané zhoršenie separačnej kapacity stĺpca podľa nášho názoru nie je významné. V dôsledku toho sa môže koncentrácia síranu sodného v tlmivom roztoku PF znížiť dvakrát v porovnaní s liekopisnými analytickými metódami.

Vo väčšine štúdií na analýzu proteínov a peptidov sa separácia uskutočňuje pri izbovej teplote. Okrem toho niektorí autori naznačujú, že vplyv teploty na selektivitu pri separácii je minimálny [48]. Avšak s rastúcou teplotou sa zrýchľuje proces hromadnej výmeny medzi stacionárnou a mobilnou fázou, čo vedie k zníženiu retenčného času peptidov a zúženiu píkov.

Inzulín je štandardizovaný pomocou

Pankreas je jedným z najdôležitejších orgánov s dvojitou sekréciou - vnútornou aj vonkajšou.
Produkt vnútornej sekrécie je inzulín, ktorý hrá dôležitú úlohu v metabolizme uhľohydrátov. Inzulín je produkt špeciálneho druhu buniek zoskupených do takzvaných ostrovov Langerhans.

Vonkajšie tajomstvo je pankreatická šťava obsahujúca trypsín - jeden z najdôležitejších tráviacich enzýmov, ktorý je vylučovaný žľazami, ktoré tvoria hlavnú masu pankreasu. Trypsín je hlavnou súčasťou pankreatínového prípravku.
Inzulín (inzulín). Inzulín bol izolovaný v čistej forme v roku 1921. Existuje veľa spôsobov jeho výroby, líšia sa od seba väčšinou len podrobne.

Vzhľadom na skutočnosť, že okrem inzulínu je enzým trypsín obsiahnutý v pankrease, ktorý inak rozpúšťa inzulín, prvé pokusy o získanie inzulínu z pankreasu zlyhali. Preto sme sa snažili získať z žľazy, v ktorých by tento enzým chýbal, napríklad z žľazy rýb alebo vnútromaternicových teliat. Ale aj tieto pokusy o úspech v produkcii nemali, pretože u rýb je veľkosť žľazy veľmi malá a vylučovanie samotnej žľazy je technicky ťažké realizovať; extrakcia žliaz z vnútromaternicových teliat vo veľkých množstvách pre výrobu predstavuje značné ťažkosti.
Nakoniec v roku 1922 experimenty s žľazou zrelého dobytka ukázali, že pri použití okysleného silného alkoholu sú enzýmy (trypsín atď.) Inaktivované a strácajú schopnosť ničiť inzulín.

Technologický plán výroby. Na výrobu inzulínu sa používa mrazená alebo čerstvá pankreas predovšetkým z hovädzieho dobytka a ošípaných.
Skartácia. Aby sa zabránilo deštrukcii hormónu trypsínom, čerstvé žľazy by mali byť najneskôr 30 minút po porážke zvieraťa vyčistené zo susedných tkanív, rozdrvené v mäsiarni.

Extrakcie. Rozdrvené žľazy sa nalejú s 95% alkoholom, okyslia sa kyselinou sírovou (1 diel žľazy je 1,5 dielov 95 ° alkoholu bez aldehydov + 0,5% kyseliny sírovej alebo kyseliny chlorovodíkovej). Zmes sa extrahuje ochladením počas 1,5 hodiny za stáleho miešania.
Prvý extrakt sa vysuší, zvyšok sa vysuší alebo odstredí. Extrakcia sa znova extrahuje 1 hodinou 60 ° alkoholu (a nie 95 °, pretože v surovine nie je žiadna vlhkosť) - jedna časť žľazy obsahuje jednu časť alkoholu. Obe extrakty sa vypúšťajú spolu a prefiltrujú cez list.

Odstraňovanie balastových bielkovín. Z získaného extraktu sa proteíny odstránia rôznymi spôsobmi:
1) usadením sa v chlade (od -4 do 0 ° С) do 48 hodín.
2) pridajte do extraktu hydroxid sodný na pH 6,6 - 6,8 (v niektorých prípadoch na pH 6,4 - 6,6).

Zrážanie sa oddelí pomocou centrifúgy, filtrácie alebo sedimentácie.
Odparovanie a odmasťovanie. Výsledná číra kvapalina sa okyslí čistou kyselinou sírovou na pH 2,5 a odparí sa na 1/10 objemu pri teplote nie vyššej ako 40 ° C.
Po odstránení všetkého alkoholu sa kvapalina odmasťuje.

Solenie a čistenie. Do filtrátu na odmastený roztok sa pridá nasýtený filtrát, po čom sa vylúči inzulín s malým množstvom balastných látok, čím sa vytvorí kôrka surového inzulínu, ktorá sa odstráni a vysuší a potom sa odmastia zmesou alkohol-éter.
Odmastený inzulín sa suší pri okolitých podmienkach a rozomelie na prášok. Prášky z výkvetov sa podrobia ďalšiemu čisteniu, aby sa získal kryštalický inzulín obsahujúci aspoň 22 U v 1 mg.
Normalizácia. Výsledný inzulín je biely alebo mierne sivý prášok. Je rozpustný vo vode a vo vodnom roztoku alkoholu až do 80 ° C, ale nerozpustný v alkohole s pevnosťou nad 90 °. Keď sa inzulín rozpustí vo vode, získa sa buď bezfarebná alebo slabo žltkastá kvapalina.

Na uchovanie sa k roztoku pridá roztok 0,3% trikresolu alebo fenolu a podrobí sa biologickej normalizácii. Keď sa inzulín aplikuje do králikov, ich obsah uhľohydrátov v krvi sa má znižovať v priemere o 50%, t.j. od 0,09 do 0,045% (viď Pharmacopoeia, 9. vydanie). Zodpovedajúca dávka sa nazýva jedna králičia jednotka, ktorá sa rovná tri ľudské alebo tri klinické.
Packaging. Roztok prechádza bakteriálnym filtrom. Potom sa filtrát naleje v aseptickom prostredí do 5 alebo 10 ml fliaš v každom mililitroku roztoku inzulínu, ktorý má obsahovať 40 alebo 80 U.

Fľaštičky sú uzavreté gumovými zátkami, ktoré sa valcujú s hliníkovými viečkami.
Štítky sa umiestňujú na fľaše a na škatuli s fľašami, na ktorých je potrebné uviesť prípravnú činnosť, dátum výroby, trvanlivosť atď.

Pred použitím inzulínu sa hliníkový uzáver otvorí, otrie alkoholom, potom sa korok prepichne sterilnou ihlou a do injekčnej striekačky, ktorá sa vstrekuje subkutánne alebo intramuskulárne, vstrekne potrebné množstvo tekutiny.
Storage. Inzulín sa uchováva vo fľaštičkách. Skladovateľnosť je 18 mesiacov pri teplote nie vyššej ako 10 ° C, pretože pri vyššej teplote môže inzulín čiastočne stratiť aktivitu.

Vonkajšie známky nevhodnosti: zakalenie roztoku alebo zrážania, vzhľad formy vo vnútri fľaštičiek alebo kolónií mikroorganizmov.

Farmakologická skupina - inzulíny

Prípravky podskupín sú vylúčené. umožniť

popis

Inzulín (z latinského Insula - ostrovček) je proteínový peptidový hormón produkovaný ß-bunkami ostrovčekov pankreasu Langerhans. Za fyziologických podmienok sa inzulín ß-buniek tvorí z preproinzulínu, jednoreťazcového prekurzorového proteínu pozostávajúceho z 110 aminokyselinových zvyškov. Po premiestnení drsného endoplazmatického retikula cez membránu sa štiepi signálny peptid s 24 aminokyselinami z preproinzulínu a vytvorí sa proinzulín. Dlhý reťazec proinzulínu v Golgiho aparáte je zabalený do granúl, kde sa v dôsledku hydrolýzy štiepia štyri hlavné aminokyselinové zvyšky, aby sa vytvoril inzulín a C-koncový peptid (fyziologická funkcia C-peptidu nie je známa).

Inzulínová molekula pozostáva z dvoch polypeptidových reťazcov. Jeden z nich obsahuje 21 aminokyselinových zvyškov (reťazec A), druhý - 30 aminokyselinových zvyškov (reťazec B). Reťaze sú spojené dvomi disulfidovými mostíkmi. Tretí disulfidový mostík sa tvorí vo vnútri reťazca A. Celková molekulová hmotnosť inzulínovej molekuly je približne 5700. Aminokyselinová sekvencia inzulínu je považovaná za konzervatívnu. Väčšina druhov obsahuje jeden inzulínový gén, ktorý kóduje jeden proteín. Výnimkou sú potkany a myši (majú dva inzulínové gény), produkujú dva inzulíny, ktoré sa líšia v dvoch aminokyselinových zvyškoch B-reťazca.

Primárna štruktúra inzulínu v rôznych biologických druhoch, vrátane a u rôznych cicavcov, trochu odlišné. Najbližšie k štruktúre ľudského inzulínu je prasačí inzulín, ktorý sa líši od človeka aminokyselinou (má alanínový zvyšok v reťazci B namiesto aminokyselinového zvyšku treonínu). Hovädzí inzulín sa líši od ľudských troch aminokyselinových zvyškov.

Historické zázemie. V roku 1921 Frederick G. Banting a Charles G. Best pracujúci v laboratóriu Johna J. R. McLeoda z University of Toronto extrahovali extrakt z pankreasu (ako sa neskôr ukázalo, že obsahuje amorfný inzulín), čo znižuje hladinu glukózy v krvi u psov s experimentálnym diabetes. V roku 1922 bol do prvého pacienta, 14-ročného Leonarda Thompsona, ktorý má cukrovku, vstreknutý extrakt pankreasu, čím sa zachránil jeho život. V roku 1923 James B. Collip vyvinul spôsob čistenia extraktu extrahovaného z pankreasu, ktorý neskôr umožnil prípravu aktívnych extraktov z pankreasových žliaz prasiat a hovädzieho dobytka, ktoré dávajú reprodukovateľné výsledky. V roku 1923 získali Banting a McLeod Nobelovu cenu za fyziológiu a medicínu za objav inzulínu. V roku 1926 získali J. Abel a V. Du-Vigno inzulín v kryštalickej forme. V roku 1939 bol prvý raz schválený inzulínom FDA (Food and Drug Administration). Frederick Sanger úplne dešifroval aminokyselinovú sekvenciu inzulínu (1949-1954), v roku 1958 dostal Sanger Nobelovu cenu za prácu na dešifrovaní štruktúry proteínov, najmä inzulínu. V roku 1963 bol syntetizovaný umelý inzulín. Prvý rekombinantný ľudský inzulín bol schválený FDA v roku 1982. Analóg inzulínu s ultra krátkym účinkom (lispro inzulín) bol schválený FDA v roku 1996.

Mechanizmus činnosti. Pri uskutočňovaní účinkov inzulínu zohráva vedúcu úlohu jeho interakcia so špecifickými receptormi lokalizovanými na plazmatickej membráne bunky a tvorbou komplexu inzulín-receptor. V kombinácii s inzulínovým receptorom vstupuje inzulín do bunky, kde ovplyvňuje fosforyláciu bunkových proteínov a spúšťa množstvo intracelulárnych reakcií.

U cicavcov sa inzulínové receptory nachádzajú takmer vo všetkých bunkách, a to ako na klasických inzulínových cieľových bunkách (hepatocyty, myocyty, lipocyty), tak na krvných bunkách, mozgu a pohlavných žľazách. Počet receptorov na rôznych bunkách sa pohybuje od 40 (erytrocyty) do 300 tisíc (hepatocyty a lipocyty). Inzulínový receptor sa neustále syntetizuje a rozkladá, polčas rozpadu je 7-12 hodín.

Inzulín receptoru je hlavný transmembránový glykoproteín pozostávajúci z dvoch a-podjednotiek s molekulovou hmotnosťou 135 kDa (každá obsahujúca zvyšok kyseliny 719 alebo 731 aminokyselín v závislosti na zostrihom mRNA) a dvoma beta-podjednotiek s molekulovou hmotnosťou 95 kDa (o 620 aminokyselinových zvyškov). Podjednotky sú prepojené disulfidovými väzbami a tvoria heterotetramérnu štruktúru β-α-α-β. Podjednotky alfa sú umiestnené extracelulárne a obsahujú miesta viažuce inzulín, čo je rozpoznávajúca časť receptora. Beta podjednotky tvoria transmembránovú doménu, majú aktivitu tyrozínkinázy a vykonávajú funkciu konverzie signálu. Väzba inzulínu na a-podjednotiek výsledkov inzulínový receptor stimuláciu tyrozín kinázovej aktivity pomocou p-podjednotky autofosforyláciu tyrosinových zvyškov dochádza agregáciu a, p-heterodiméry a rýchle internalizáciu komplexov hormonálnych receptorov. Aktivovaný inzulínový receptor začína kaskádu biochemických reakcií, vrátane fosforylácia iných proteínov v bunke. Prvou z týchto reakcií je fosforylácia štyroch proteínov nazývaných substrátmi inzulínového receptora (substrát inzulínového receptora), IRS-1, IRS-2, IRS-3 a IRS-4.

Farmakologické účinky inzulínu. Inzulín postihuje prakticky všetky orgány a tkanivá. Jeho hlavnými cieľmi však sú pečeňové, svalové a tukové tkanivá.

Endogénny inzulín je najdôležitejším regulátorom metabolizmu uhľohydrátov, exogénny inzulín je špecifickým činidlom redukujúcim cukor. Účinok inzulínu na metabolizmus sacharidov je spôsobený tým, že zvyšuje transport glukózy cez bunkovú membránu a jej využitie v tkanivách, prispieva k premenu glukózy na glykogén v pečeni. Inzulín tiež inhibuje endogénnej produkcii glukózy potlačením glykogenolýzy (rozklad glukózy na glykogén) a glukoneogenézu (syntéza glukózy zo zdrojov mimo sacharidov - napríklad z aminokyselín, mastných kyselín). Okrem hypoglykemických má aj inzulín množstvo ďalších účinkov.

Účinok inzulínu na metabolizmus tukov sa prejavuje inhibíciou lipolýzy, čo vedie k zníženiu prietoku voľných mastných kyselín do krvného obehu. Inzulín zabraňuje tvorbe ketolín v tele. Inzulín zvyšuje syntézu mastných kyselín a ich následnú esterifikáciu.

Inzulín sa podieľa na metabolizme bielkovín: zvyšuje transport aminokyselín cez bunkovú membránu, stimuluje syntézu peptidov, znižuje spotrebu bielkovín tkanivami a inhibuje konverziu aminokyselín na keto kyseliny.

Inzulín akcia je sprevádzaná aktiváciou alebo inhibíciou niektorých enzýmov: stimulované glykogén-syntetázu, pyruvát, hexokináza, inhibovaná lipázy (lipidov a hydrolýzu tukového tkaniva, a lipoproteínových lipáz zníženie "zakalenie" v krvnom sére po požití potravy bohatej na tuky).

Vo fyziologickej regulácii biosyntézy a sekrécie inzulínu pankreasou hrá hlavnú úlohu koncentrácia glukózy v krvi: s rastom jej obsahu zvyšuje sekrécia inzulínu a pri poklese sa spomaľuje. Vylučovanie inzulínu je okrem glukózy ovplyvnené elektrolytmi (najmä Ca2 + iónmi), aminokyselinami (vrátane leucínu a arginínu), glukagónom, somatostatínom.

Farmakokinetika. Inzulínové prípravky sa injikujú s / c, intramuskulárne alebo intravenózne (v / v, podávajú sa len krátkodobo pôsobiace inzulíny a iba v diabetických prekomách a kóme). Nie je možné vstúpiť do / v inzulínových suspenziách. Teplota inzulínu by mala byť pri izbovej teplote, pretože studený inzulín sa absorbuje pomalšie. Najoptimálnejší spôsob kontinuálnej inzulínovej liečby v klinickej praxi je sc.

Úplnosť absorpcie a nástup účinku inzulínu závisí od miesta vpichu injekcie (zvyčajne sa vstrekne inzulín do brucha, stehien, hýždeň, horných ramien), dávka (objem injekčného inzulínu), koncentrácia inzulínu v prípravku atď.

Rýchlosť absorpcie inzulínu do krvi z miesta vpichu závisí od množstva faktorov - ako je inzulín, miesto vpichu, prietok miestnej krvi, lokálna svalová aktivita, množstvo injekčného inzulínu (odporúča sa injekcia nie viac ako 12-16 U liečiva na jedno miesto). Najrýchlejšie vstupuje inzulín do krvi z podkožného tkaniva prednej brušnej steny, pomalšie od ramena, predného povrchu stehna a ešte pomalšie od podskupín a hýždeň. To je spôsobené stupňom vaskularizácie subkutánneho mastného tkaniva uvedených oblastí. Akčný profil inzulínu je vystavený výrazným výkyvom u rôznych ľudí a rovnakej osoby.

Krv inzulínu sa viaže na alfa a beta globulíny, OK - 5 až 25%, ale môže zvýšiť väzbu liečby z dôvodu prítomnosti protilátok v sére (protilátky proti exogénne produkcie inzulínu vedie k inzulínovej rezistencie, s využitím moderných vysoko purifikovanej inzulínové prípravky zriedka ). T1/2 krvi je menej ako 10 minút. Väčšina inzulínu uvoľneného do krvného riečišťa prechádza proteolytickým poškodením pečene a obličiek. Rýchlo sa vylučuje obličkami (60%) a pečeňou (40%); menej ako 1,5% sa vylučuje močom nezmenené.

Inzulínové prípravky, ktoré sa v súčasnosti používajú, sa líšia rôznymi spôsobmi (kyslý a neutrálny), prítomnosť konzervačných látok (fenol, krezol, fenolkresol, metylparabén), koncentrácia inzulínu 40, 80, 100, 200, 500 U / ml.

Klasifikácia. Inzulíny sú zvyčajne klasifikované podľa pôvodu (hovädzí dobytok, ošípané, človek, rovnako ako analógy ľudského inzulínu) a trvanie účinku.

V závislosti od zdrojov výroby sa líšia inzulíny živočíšneho pôvodu (hlavne bravčové inzulínové prípravky), polosyntetické preparáty ľudského inzulínu (získané z bravčového inzulínu enzymatickou transformáciou), ľudské inzulínové prípravky (DNA-rekombinantné, produkované genetickým inžinierstvom).

Na lekárske použitie bol inzulín predtým získaný hlavne z pankreasu hovädzieho dobytka a potom z pankreasových žliaz prasiat, vzhľadom na to, že ošípaný inzulín je bližšie k ľudskému inzulínu. Keďže hovädzí inzulín, ktorý sa líši od ľudských troch aminokyselín, často spôsobuje alergické reakcie, dnes sa prakticky nepoužíva. Prasací inzulín, ktorý sa líši od ľudskej jednej aminokyseliny, je menej pravdepodobné, že spôsobí alergické reakcie. V inzulínových liekových prípravkoch, ak nie je dostatočné čistenie, môžu byť prítomné nečistoty (proinzulín, glukagón, somatostatín, proteíny, polypeptidy), ktoré môžu spôsobiť rôzne vedľajšie reakcie. Moderné technológie umožňujú získať purifikovaný (mono-vrchol-chromatograficky purifikovaný s uvoľňovaním "vrcholu" inzulínu), vysoko čistené (monokomponentné) a kryštalizované inzulínové prípravky. Z prípravkov inzulínu živočíšneho pôvodu je uprednostňovaný mono-vrcholový inzulín odvodený zo slinivky bravčových ošípaných. Inzulín získaný genetickým inžinierstvom je plne v súlade s aminokyselinovým zložením ľudského inzulínu.

Inzulínová aktivita sa určuje biologickou metódou (podľa schopnosti znížiť glukózu v králikoch) alebo fyzikálno-chemickou metódou (elektroforézou na papieri alebo chromatografiou na papieri). Pre jednu jednotku účinku alebo medzinárodnú jednotku vykonajte aktivitu 0,04082 mg kryštalického inzulínu. Ľudská pankreas obsahuje až 8 mg inzulínu (približne 200 U).

Inzulínové prípravky trvanie je rozdelená do preparátov, krátke a rýchlo pôsobiace - napodobňujú normálne fyziologickú sekréciu inzulínu v pankrease v reakcii na stimuláciu, prípravky dĺžky a dlho pôsobiace formulácie - napodobňujú sekréciu inzulínu bazálnej (pozadia), rovnako ako kombinovaných prípravkov (kombinujúci dva kroky),

Existujú nasledujúce skupiny:

Inzulíny s veľmi krátkym účinkom (hypoglykemický účinok sa rozvíja 10-20 minút po injekcii s / c, vrchol účinku sa dosahuje v priemere po 1-3 hodinách, trvanie účinku je 3-5 hodín):

- inzulín lispro (Humalog);

- inzulín aspart (NovoRapid Penfill, NovoRapid FlexPen);

- inzulín glulizín (apidra).

Krátkodobo pôsobiace inzulíny (nástup účinku zvyčajne po 30-60 minútach, maximálna účinnosť po 2-4 hodinách, trvanie účinku až 6-8 hodín):

- rozpustný inzulín (ľudské genetické inžinierstvo) (Actrapid HM, Gensulín R, Rinsulín R, Humulin Regular);

- rozpustný inzulín [ľudský polosyntetický] (Biogulin R, Humodar R);

- rozpustný inzulín (monokomponent prasaťa) (Actrapid MS, Monodar, Monosuinsulin MK).

Inzulínové prípravky s dlhodobým účinkom zahŕňajú lieky s priemernou dobou účinku a lieky s dlhodobým účinkom.

Inzulíny so strednou dobou účinku (nástup po 1,5 - 2 hodinách, vrchol po 3 - 12 hodinách, trvanie 8 - 12 hodín):

- -Isophane inzulínu [Human Genetic Engineering] (Biosulin H Gansulin H Gensulin N, Insuman Basal HT Insuran NPH Protafan HM, Rinsulin NPH, Humulin NPH);

- inzulín-izofán [ľudský polosyntetický] (Biogulin N, Humodar B);

- inzulín-izofán [monokomponent prasaťa] (Monodar B, Protafan MS);

- inzulínová suspenzia zinočnatých zlúčenín (Monotard MS).

Dlhodobo pôsobiace inzulíny (začiatok po 4-8 hodinách, vrchol po 8-18 hodinách, celková doba trvania 20-30 h):

- inzulín glargín (Lantus);

- inzulín detemir (Levemir Penfill, Levemir FlexPen).

Kombinované inzulínové prípravky (dvojfázové prípravky) (hypoglykemický účinok začína 30 minút po podaní s / c, dosahuje maximum po 2 až 8 hodinách a trvá až 18-20 hodín):

- bifázický inzulín [ľudský polosyntetický] (Biogulin 70/30, Humodar K25);

- bifázický inzulín (ľudský genetický inžinier) (Gansulin 30P, Gensulin M 30, Insuman Comb 25 GT, Mikstaard 30 NM, Humulin M3);

- inzulín aspart bifázický (Novomix 30 Penfill, Novomix 30 FlexPen).

Inzulíny s krátkym pôsobením sú analógy ľudského inzulínu. Je známe, že endogénne inzulínu beta-buniek pankreasu, rovnako ako molekuly produkované v hormonálnych riešení krátkodobo pôsobiacim inzulínom polymerizujú a hexamérov. Keď sa s / na hexamerní formy sú absorbované pomalšie a maximálna koncentrácia v krvi hormónu, podobne ako u zdravého človeka po jedle, nemôže byť vytvorený. Prvý krátkodobo pôsobiaci analóg inzulínu, ktorý je absorbovaný z podkožia 3 krát rýchlejšie ako ľudský inzulín, inzulín lispro bol. Inzulín lispro - derivátov ľudského inzulínu, získaná permutácií dvoch aminokyselinových zvyškov v inzulínovej molekuly (lyzín a prolín v polohe 28 a 29 B-reťazca). Modifikácia molekuly inzulínu narušuje tvorbu hexamérov a zabezpečuje rýchle dodávanie lieku do krvi. Takmer okamžite po s / k zavedeniu do tkanív inzulínovej molekuly lispro hexamérov tak rýchlo, disociujú na monoméry a do krvného obehu. Ďalší inzulínový analóg - inzulín aspart - bol vytvorený nahradením prolínu v polohe B28 záporne nabitou kyselinou asparágovou. Rovnako ako inzulín lispro, po sc injekcii sa tiež rýchlo rozpadá na monoméry. V inzulín glulizín substitúciu aminokyseliny asparagínu na B3 ľudský inzulín v polohách lyzínu a lyzínu v pozícii B29 kyselinou glutámovú tiež podporuje rýchlejšie absorpciu. Inzulínové analógy s veľmi krátkym účinkom sa môžu podávať bezprostredne pred jedlom alebo po jedle.

Krátko pôsobiace inzulíny (tiež nazývané rozpustné) sú roztoky v pufri s neutrálnymi hodnotami pH (6,6-8,0). Sú určené na subkutánne, menej často intramuskulárne podanie. Ak je to potrebné, podávajú sa tiež intravenózne. Majú rýchly a relatívne krátky hypoglykemický účinok. Účinok po subkutánnej injekcii nastane po 15 až 20 minútach, po 2 hodinách dosiahne maximum; celkový čas asi 6 hodín, ktoré sa používajú najmä v nemocnici pri vytváraní požadovanej dávky inzulínu pacientovi, rovnako ako vyžadujúce rýchle (naliehavé) efekt -. u diabetickej kóma a precoma. S / v úvode T1/2 počas 5 minút sa pri diabetickej ketoacidotickej kóme podáva inzulín v kvapkaní. Krátkodobo pôsobiace inzulínové prípravky sa tiež používajú ako anabolické látky a predpisujú sa spravidla v malých dávkach (4-8 IU 1-2 krát denne).

Inzulíny priemerné trvanie účinku menej rozpustné, pomaly vstrebáva z podkožného tkaniva, a tým vykazujú trvalý účinok. Dlhšie pôsobenie týchto látok je dosiahnuté prítomnosťou zvláštnych prolongator - protamínu (isofan, Protafan, bazálnej) alebo zinku. Spomalenie absorpcie inzulínu v prípravkoch obsahujúcich suspenziu zlúčeniny zinku z inzulínu v dôsledku prítomnosti kryštálov zinku. NPH-inzulín (NPH inzulín alebo Isophane) je suspenzia inzulínu protamín (protamínu - proteín izolovaný z mlieča rýb), v stechiometrickom pomere.

Tým, dlhodobo pôsobiaci inzulíny sa týka inzulín glargín - analóg ľudského inzulínu produkovaného rekombinantnej DNA technológiou - prvý inzulínový liek, ktorý nemá žiadny výrazný vrchol akciu. Inzulínu glargín sa vyrába dvoma modifikáciami inzulínovej molekuly na: substitúcie v polohe 21 A-reťazca (asparagín), do glycínový a pridaním dvoch argininových zvyškov na C-koniec B-reťazca. Prípravok je číry roztok pri pH 4. Kyslé pH stabilizuje inzulín hexamérov a zaisťuje dlhú a predvídateľné absorpciu liečivá zo subkutánnej tkaniva. Avšak kvôli kyslému pH sa inzulín glargín nemôže kombinovať s krátko pôsobiacimi inzulínmi, ktoré majú neutrálne pH. Jedna injekcia inzulínu glargín poskytuje 24-hodinovú kontrolu nad glykémiou. Väčšina inzulínových prípravkov má tzv. "Špičkový" účinok, zaznamenaný, keď koncentrácia inzulínu v krvi dosiahne maximum. Inzulín glargín nemá výrazný vrchol, pretože sa uvoľňuje do krvného riečiska relatívne konštantnou rýchlosťou.

Inzulínové prípravky s predĺženým účinkom sú dostupné v rôznych dávkových formách, ktoré majú hypoglykemický účinok s rôznym trvaním (od 10 do 36 hodín). Predĺžený účinok znižuje počet denných injekcií. Zvyčajne sa vyrábajú vo forme suspenzií, ktoré sa podávajú len subkutánne alebo intramuskulárne. V stave diabetickej kómy a prekomatózy sa nepoužívajú dlhodobé lieky.

Kombinované inzulínové prípravky sú suspenzie pozostávajúce z neutrálneho rozpustného inzulínu s krátkym účinkom a inzulín-izofánu (stredné trvanie účinku) v určitých pomeroch. Táto kombinácia inzulínov s rôznym trvaním účinku v jednom prípravku umožňuje pacientovi ušetriť dve injekcie s oddeleným užívaním liekov.

Indikácie. Hlavnou indikáciou pre inzulín je diabetes typu 1, ale v niektorých prípadoch sa podáva, a diabetes typu 2, vrátane keď odolnosť voči orálnych hypoglykemických činidiel, v ťažkých súčasne inými chorobami, v príprave na chirurgický zákrok, diabetickej kóma, diabetes u tehotných žien. Krátko pôsobiace inzulíny sa používajú nielen diabetes, ale aj v niektorých iných patologických procesoch, napríklad v celkovej vyčerpania (ako anaboliká), furunkulóza, tyreotoxikóza, ochorenie žalúdka (atónia, gastroptóza), chronická hepatitída, primárna formy cirhózy ako aj pri niektorých duševných ochoreniach (podávanie veľkých dávok inzulínu - tzv. hypoglykemickej kómy); niekedy sa používa ako zložka "polarizujúcich" roztokov používaných na liečbu akútneho zlyhania srdca.

Inzulín je hlavnou špecifickou liečbou diabetes mellitus. Liečba diabetes mellitus sa uskutočňuje podľa špeciálne vyvinutých schém s použitím inzulínových prípravkov s rôznym trvaním účinku. Výber liečiva závisí od závažnosti a charakteristík priebehu ochorenia, celkového stavu pacienta a rýchlosti nástupu a trvania účinku liečiva na znižovanie obsahu cukru.

Všetky inzulínové prípravky sa používajú pod podmienkou povinného dodržiavania stravovacieho režimu s obmedzením energetickej hodnoty potravín (od 1 700 do 3 000 kcal).

Pri určovaní dávky inzulínu sa vedú hladinou glukózy nalačno a počas dňa, ako aj hladinou glykozúrie počas dňa. Konečná selekcia dávky sa uskutočňuje pod kontrolou zníženia hyperglykémie, glykozúrie, ako aj celkového stavu pacienta.

Kontraindikácie. Inzulín je kontraindikované u ochorení a stavov, ktoré sa vyskytujú s hypoglykémie (inzulinómami napríklad), akútna pečene, pankreasu, obličiek, žalúdočných vredov a dvanástnikových vredov, dekompenzované srdcové ochorenia, akútne koronárne nedostatočnosti a ďalších chorôb.

Používajte počas tehotenstva. Hlavnou liekovou liečbou diabetes mellitus počas tehotenstva je inzulínová terapia, ktorá sa vykonáva pod prísnym dohľadom. V prípade diabetes mellitus typu 1 pokračuje liečba inzulínom. V prípade diabetes mellitus typu 2 sa perorálne hypoglykemické lieky zrušia a diétna terapia sa vykonáva.

Gestačný diabetes mellitus (gravidný diabetes) je porucha metabolizmu sacharidov, ktorá sa prvýkrát objavila počas tehotenstva. Gestačný diabetes mellitus je spojený so zvýšeným rizikom perinatálnej mortality, výskytu vrodených malformácií, ako aj s rizikom progresie diabetu 5-10 rokov po pôrode. Liečba gestačného diabetu začína dietou. Ak je diétna terapia neúčinná, používa sa inzulín.

U pacientov s predtým existujúcim alebo gestačným diabetes mellitus je dôležité udržiavať adekvátnu reguláciu metabolických procesov počas tehotenstva. Potreba inzulínu sa môže znížiť v prvom trimestri gravidity a zvýšenie v druhom a treťom trimestri. Počas pôrodu a hneď po ňom môže dramaticky klesnúť potreba inzulínu (riziko hypoglykémie stúpa). Za týchto podmienok je dôležité dôkladné monitorovanie hladiny glukózy v krvi.

Inzulín nepreniká do placentárnej bariéry. Materské IgG protilátky proti inzulínu však prechádzajú placentou a pravdepodobne spôsobujú hyperglykémiu u plodu neutralizáciou inzulínu vylučovaného z neho. Na druhej strane môže nežiaduca disociácia komplexov inzulín-protilátka viesť k hyperinzulinémii a hypoglykémii u plodu alebo novorodenca. Bolo preukázané, že prechod od prípravkov na báze hovädzieho / prasacieho inzulínu do jednokomponentných prípravkov je sprevádzaný poklesom titra protilátok. V tomto ohľade sa počas tehotenstva odporúča používať len prípravky s ľudským inzulínom.

Inzulínové analógy (podobne ako iné novo vyvinuté lieky) sú predpisované opatrne počas tehotenstva, hoci neexistujú spoľahlivé dôkazy o nežiaducich účinkoch. Podľa FDA uznávaných odporúčaní (Food and Drug Administration), určujúcich možnosť užívania drog počas tehotenstva, príprava inzulínu v závislosti na ovocie akcie sú rozdelené do kategórií ako B (štúdie reprodukcie u zvierat preukázali nežiaduce účinky na plod, a zodpovedajúce a dobre kontrolované štúdie u tehotných žien ženy neboli vykonané) alebo do kategórie C (reprodukčné štúdie na zvieratách ukázali nepriaznivý účinok na plod a neuskutočnili sa adekvátne a dobre kontrolované štúdie u tehotných žien, ale potenciálne prínosy spojené s užívaním liekov u tehotných žien môžu napriek možným rizikám odôvodniť jeho použitie. Inzulín lizpro teda patrí do triedy B a inzulín aspart a inzulín glargín - do triedy C.

Komplikácie inzulínovej liečby. Hypoglykémia. Zavedenie príliš vysokých dávok, ako aj nedostatok príjmu uhľohydrátov s jedlom môže spôsobiť nežiaduci hypoglykemický stav, hypoglykemická kóma sa môže vyvinúť so stratou vedomia, kŕčmi a depresiou srdcovej aktivity. Hypoglykémia sa môže tiež vyvíjať v dôsledku pôsobenia ďalších faktorov, ktoré zvyšujú citlivosť na inzulín (napríklad adrenálna insuficiencia, hypopituitarizmus) alebo zvyšujú tkanivovú absorpciu glukózy (cvičenie).

Skoré symptómy hypoglykémie, ktorá je z veľkej časti spojené s aktiváciou sympatického nervového systému (adrenergné príznaky) zahŕňajú tachykardiu, studený pot, triaška, s aktiváciou parasympatického systému - silný hlad, nevoľnosť a mravčenie v pier a jazyka. Pri prvom príznaku hypoglykémie je potrebné prijať urgentné opatrenia: pacient by mal piť sladký čaj alebo jesť pár kúskov cukru. V hypoglykemickej kóme sa do žily vstrekuje 40% roztok glukózy v množstve 20-40 ml alebo viac, kým pacient opustí stav komatózy (zvyčajne nie viac ako 100 ml). Hypoglykémia sa môže tiež odstrániť intramuskulárnym alebo subkutánnym podaním glukagónu.

Zvýšenie telesnej hmotnosti počas liečby inzulínom je spojené s elimináciou glukozúrie, zvýšením skutočného obsahu kalórií v potravinách, zvýšením chuti do jedla a stimuláciou lipogenézy pôsobením inzulínu. Ak dodržiavate zásady výživy, je možné vyhnúť sa vedľajšiemu účinku.

Použitie moderných vysoko purifikovaných hormonálnych liekov (najmä geneticky upravených ľudských inzulínových prípravkov) relatívne zriedkavo vedie k rozvoju inzulínovej rezistencie a alergií, avšak takéto prípady nie sú vylúčené. Vývoj akútnej alergickej reakcie si vyžaduje okamžitú desenzibilizujúcu liečbu a výmenu lieku. Pri vývoji reakcie na prípravky z hovädzieho a bravčového inzulínu je potrebné ich nahradiť prípravkami na ľudský inzulín. Lokálne a systémové reakcie (svrbenie, miestne alebo systémové vyrážka, podkožný tvorba uzol v mieste vpichu), sú spojené s nedostatočným čistením inzulínu od nečistôt alebo za použitia hovädzieho alebo bravčového inzulínu, ktoré sa líšia v aminokyselinové sekvencii od človeka.

Najčastejšími alergickými reakciami sú kožné IgE-sprostredkované protilátky. Občas sa pozorujú systémové alergické reakcie, ako aj inzulínová rezistencia sprostredkovaná protilátkami IgG.

Rozmazané videnie Prechodné poruchy refrakcie oka sa vyskytujú už na začiatku liečby inzulínom a zaniknú samy o sebe po 2-3 týždňoch.

Opuch. V prvých týždňoch liečby sa vyskytuje aj prechodný opuch nôh kvôli zadržiavaniu tekutín, tzv. opuch inzulínu.

Lokálne reakcie zahŕňajú lipodystrofiu v mieste opakovaných injekcií (zriedkavé komplikácie). Priraďte lipoatrofiu (zmiznutie usadenín podkožného tuku) a lipohypertrofiu (zvýšené ukladanie podkožného tuku). Tieto dva štáty majú odlišnú povahu. Lipoatrofia - imunologická reakcia, hlavne kvôli podávaniu zle purifikovaných inzulínových prípravkov živočíšneho pôvodu, sa prakticky nenašla. Lipohypertrofia sa vyvíja s použitím vysoko purifikovaných ľudských inzulínových prípravkov a môže sa vyskytnúť, ak je injekčná technika narušená (studený prípravok, alkohol dostane pod kožu) a tiež kvôli anabolickému miestnemu pôsobeniu samotného prípravku. Lipohypertrofia vytvára kozmetickú poruchu, ktorá je pre pacientov problémom. Navyše, kvôli tejto poruche je znížená absorpcia lieku. Aby sa zabránilo rozvoju lipohypertrofie, odporúča sa neustále meniť miesta vpichu v tej istej oblasti, pričom medzi dvoma prerazeniami zostávajú aspoň 1 cm.

Môžu sa vyskytnúť miestne reakcie, ako je bolesť v mieste podania.

Interakcie. Inzulínové prípravky je možné kombinovať navzájom. Mnoho liekov môže spôsobiť hypo- alebo hyperglykémiu alebo zmeniť reakciu pacienta s diabetes mellitus na liečbu. Mali by ste zvážiť interakciu, ktorá je možná pri súčasnom používaní inzulínu inými liekmi. Alfa-blokátory a beta-adrenomimetiki zvyšujú sekréciu endogénneho inzulínu a zvyšujú účinok lieku. Hypoglykemický účinok inzulínu zvýšiť perorálne antidiabetiká, salicyláty, inhibítory MAO (vrátane furazolidon, prokarbazín, selegilín), inhibítory ACE, bromokriptín, oktreotid, sulfónamidy, anabolické steroidy (najmä oxandrolone, methandienone) a androgénov (zvýšená citlivosť na inzulín a zvýšenie odolnosti tkaniva na glukagón, čo vedie k hypoglykémii, najmä v prípade rezistencie na inzulín, možno budete musieť znížiť dávku inzulínu), analógy somatostatínu, guanatidín, dizo pyramídy, klofibrát, ketokonazol, lítia prípravky, mebendazol, pentamidín, pyridoxín, propoxyfén, fenylbutazón, fluoxetín, teofylín, fenfluramín, lítium, prípravky vápnika, tetracyklíny. Chlórchin, chinidín, chinín znižujú degradáciu inzulínu a môžu zvýšiť koncentráciu inzulínu v krvi a zvýšiť riziko hypoglykémie.

Inhibítory karboanhydrázy (najmä acetazolamid) stimuláciou pankreatických ß-buniek podporujú uvoľňovanie inzulínu a zvyšujú citlivosť receptorov a tkanív na inzulín; hoci súbežné použitie týchto liekov s inzulínom môže zvýšiť hypoglykemický účinok, účinok môže byť nepredvídateľný.

Množstvo liekov spôsobuje hyperglykémiu u zdravých ľudí a zhoršuje priebeh ochorenia u pacientov s cukrovkou. Hypoglykemický účinok inzulínu je oslabený: antiretrovírusové lieky, asparagináza, perorálne hormonálne kontraceptíva, glukokortikoidy, diuretiká (tiazid, kyselina etakrynová), heparín, antagonisty H2-receptory, sulfinpyrazón, tricyklické antidepresíva, dobutamín, izoniazid, kalcitonínu, niacín, sympatomimetiká, danazol, klonidín, CCB, diazoxid, morfín, fenytoín, rastový hormón, hormóny štítnej žľazy, fenotiazínové deriváty, nikotín, etanol.

Glukokortikoidy a epinefrín majú opačný účinok ako inzulín na periférne tkanivá. Napríklad dlhodobé užívanie glukokortikoidov môže spôsobiť systémovú hyperglykémii, kým diabetes (steroidné diabetes), ktorá môže byť pozorovaná u približne 14% pacientov užívajúcich systémové kortikosteroidy počas niekoľkých týždňov alebo dlhšom používaní lokálnych kortikosteroidov. Niektoré lieky inhibujú sekréciu inzulínu priamo (fenytoín, klonidín, diltiazem) alebo redukciou zásob draslíka (diuretík). Hormóny štítnej žľazy urýchľujú metabolizmus inzulínu.

Najvýznamnejšie a často ovplyvňujú účinok beta-blokátorov inzulínu, perorálnych hypoglykemických látok, glukokortikoidov, etanolu a salicylátov.

Etanol inhibuje glukoneogenézu v pečeni. Tento účinok sa pozoruje u všetkých ľudí. V tejto súvislosti je potrebné mať na pamäti, že zneužívanie alkoholických nápojov na pozadí inzulínovej liečby môže viesť k vzniku ťažkého hypoglykemického stavu. Malé množstvo alkoholu užívané s jedlom zvyčajne nespôsobuje problémy.

Beta-blokátory môžu inhibovať sekréciu inzulínu, meniť metabolizmus uhľohydrátov a zvyšovať periférnu rezistenciu voči inzulínu, čo vedie k hyperglykémii. Avšak môžu tiež inhibovať účinok katecholamínov na glukoneogenézu a glykogenolýzu, čo je spojené s rizikom ťažkých hypoglykemických reakcií u diabetických pacientov. Okrem toho môže ktorýkoľvek z beta-adrenergných blokátorov maskovať adrenergné symptómy spôsobené znížením hladín glukózy v krvi (vrátane tremoru, palpitácie), čím narušuje pacientovo včasné rozpoznanie hypoglykémie. Selektívne beta1-adrenergné blokátory (vrátane acebutololu, atenololu, betaxololu, bisoprololu, metoprololu) vykazujú tieto účinky v menšom rozsahu.

NSAID a vysoko dávkové salicyláty inhibujú syntézu prostaglandínu E (ktorý inhibuje sekréciu endogénneho inzulínu) a tak zvyšujú bazálnu sekréciu inzulínu, zvyšujú citlivosť p-buniek pankreasu na glukózu; hypoglykemický účinok pri súčasnom používaní môže vyžadovať úpravu dávky NSAID alebo salicylátov a / alebo inzulínu, najmä pri dlhodobom zdieľaní.

V súčasnosti sa vyrába značný počet inzulínových prípravkov, vrátane odvodené z pankreasu zvierat a syntetizované genetickým inžinierstvom. Prípravy na výber inzulínovej terapie sú geneticky upravené vysoko purifikované ľudské inzulíny s minimálnou antigénnosťou (imunogénna aktivita), ako aj analógy ľudského inzulínu.

Inzulínové prípravky sa vyrábajú v sklenených liekovkách, hermeticky uzavretých gumovými zátkami s hliníkovým chodom, špeciálne tzv. inzulínových striekačiek alebo striekačiek. Ak používate injekčné perá, prípravky sú v špeciálnych injekčných liekovkách (penfill).

Užívajú sa intranazálne formy inzulínu a inzulínových prípravkov na orálne podávanie. Pomocou kombinácie inzulínu s detergentom a podávaním vo forme aerosólu na nosnej sliznici sa účinná plazmatická hladina dosiahne tak rýchlo, ako pri IV bolusovom podaní. Intranazálne a perorálne inzulínové prípravky sa vyvíjajú alebo podstupujú klinické skúšky.