Stanovenie glukózy metódou glukózooxidázy

Analýzy

Určenie koncentrácie glukózy v krvi je jednou z najčastejšie vykonávaných biochemických štúdií v laboratóriách.

Metóda glukózovej oxidázy na stanovenie glukózy v krvi a v moči je založená na reakcii oxidácie glukózy v prítomnosti enzýmu glukózooxidázy s tvorbou peroxidu vodíka, ktorý naopak v prítomnosti peroxidázy oxiduje ortotolidín na farebné produkty; o Koncentrácia glukózy je sľubovaná množstvom farebných produktov.

Keďže metóda glukózooxidázy je zameraná na identifikáciu glukózy a nie všetkých druhov cukrov, používa sa na diferenciálnu diagnostiku nasledujúcich ochorení:

Princíp metódy glukózooxidázy na stanovenie glukózy

Glukóza v prítomnosti enzýmu glukózooxidázy je oxidovaná atmosférickým kyslíkom za vzniku peroxidu vodíka počas reakcie. Peroxid vodíka v prítomnosti peroxidázového enzýmu oxiduje ortotoluidín na vytvorenie farebnej zlúčeniny, ktorej intenzita farby je úmerná obsahu glukózy. Táto metóda vám umožňuje určiť hladinu glukózy v krvnej plazme, v sére a v mozgovomiechovej tekutine.

Normálna hladina glukózy v krvi, mmol / l

- v plazme, v nateheartse

novorodenci - 1,7 - 4,2
deti od 6 týždňov do 15 rokov - 3,3 - 5,4
dospelí (muži, ženy) - 3,9 - 5,6

- v sére, v natsheartse

novorodenci - 2.6 - 4.2
deti od 6 týždňov do 2 rokov - 3,3 - 5,4
dospelí (muži, ženy) - 3,9 - 5,6

Potrebné činidlá na stanovenie glukózy metódou glukózooxidázy

1. Chlorid sodný 9 gramov / liter (izotonický roztok): pripravený rozpustením 0,9 g chloridu sodného v 100 ml vody.

2. Síran zinočnatý, 50 g / l: 5 g síranu zinočnatého (ZnS04) sa rozpustí vo vode a objem sa upraví na 100 ml.

3. Hydroxid sodný, 0,3 mol / l: pripravený rozpustením 1,2 g NaOH v 100 ml vody, koncentrácia sa kontroluje titráciou (mala by byť 0,3 n).

4. Ortotoluidín, 1% roztok: 1 g liečiva sa rozpustí v 100 ml absolútneho alkoholu. Roztok sa môže skladovať v chladničke v banke so sklenou zátkou niekoľko mesiacov. Komerčne dostupný produkt sa môže prečistiť rekryštalizáciou, pri ktorej sa rozpustí v absolútnom alkohole, pridá sa voda a vyzrážané kryštály sa odsajú na filtri a potom sa vysušia chloridom vápenatým.

5. Acetátový tlmivý roztok pH 4,8: zmieša sa 4 diely 0,25 n kyseliny octovej (kontrola titráciou) a 6 dielov 0,25 n octanu sodného (obsahuje 34 g CH3COONa X 3H2O v 1 litri).

6. Glukózooxidáza je suchý prípravok s aktivitou 3000 jednotiek / mg alebo viac.

7. Chrenová peroxidáza. 1 mg sa rozpustí v 5 ml acetátového tlmivého roztoku, môže sa skladovať v chladničke niekoľko dní.

8. Pracovné činidlo: rozpustite 2 mg glukózooxidázy a 1 mg peroxidázy v 80 ml acetátového tlmivého roztoku, pridajte 1 ml 1% roztoku ortotoluidínu, premiešajte a doplňte objem na 100 ml tlmivým roztokom. Pracovné činidlo musí byť priehľadné, bezfarebné alebo má slabý, zelený odtieň, v tomto prípade je pri skladovaní v chlade stabilný. Ak je farba intenzívna alebo po niekoľkých hodinách po príprave začne zrážať, znamená to, že ortotoluidín nie je dostatočne čistý a musí byť rekryštalizovaný.

9. Kalibrácia roztokov glukózy. Glukóza sa predsušila pri 37 ° C a skladovala sa v exsikátore. Najskôr pripravte zásaditý roztok s koncentráciou 50 mmol / l, pre ktorý sa 180 mg látky rozpustí v 20 ml nasýteného roztoku kyseliny benzoovej (približne 0,3%). Z tohto roztoku pripravte pracovné kalibračné roztoky obsahujúce 3; 6; 9; 12; 15; 18 a 21 mmol / l, pre ktoré majú 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 a 4,2 ml zásaditého roztoku a nasýtený roztok kyseliny benzoovej sa doplní na objem 10 ml. Tieto roztoky obsahujú glukózu v rovnakých koncentráciách, ako sa vyskytuje v krvi, čo uľahčuje výpočty počas kalibrácie.

Priebeh stanovenia glukózy metódou glukózooxidázy

V centrifugačných skúmavkách pridajte 1,1 ml roztoku chloridu sodného, 0,4 ml roztoku síranu zinočnatého a 0,4 ml 0,3 n roztoku NaOH, premiešajte; súčasne sa vytvorí veľmi tenký gél hydroxidu zinočnatého, do neho sa uvoľní 0,1 ml krvi alebo kalibračného roztoku, opäť sa zmieša a odstreďuje sa po 10 minútach pri rýchlosti 3000 ot./min počas 10 minút.

Do 1 ml supernatantu sa pridá 3 ml pracovného činidla a jemne sa premieša.

Postupne sa začína rozvíjať farba, ktorá pri normálnej izbovej teplote dosiahne maximálne 13-15 minút a potom sa postupne znižuje. Fotometricky vždy po rovnakom čase po pridaní pracovného činidla do kyvety s dĺžkou optickej dráhy 1 centimetra s filtrom červeného svetla (vlnová dĺžka 625 nm) proti nečinnosti, ktorá sa nastavuje súčasne s pracovnými vzorkami, ale namiesto krvi sa podá fyziologický roztok chloridu sodného.

Pri príprave kalibračného grafu sa namiesto krvných vzoriek odoberie 0,1 ml príslušného kalibračného roztoku.

Výpočet glukózy sa môže uskutočniť podľa proporcionálneho pravidla alebo kalibračného plánu na zostrojenie koncentrácie glukózy (mmol / l) na jednu os a extinkčná hodnota na druhej.

Poznámky k metóde stanovenia glukózy metódou glukózooxidázy

1. Najprv môžete uvoľniť krv z pipety do izotonického roztoku chloridu sodného a potom pridať roztoky síranu zinočnatého a NaOH.

2. Pri systematickej práci nie je potrebné neustále zostavovať kalibračný plán pre všetky body, postačuje spracovanie slepého pokusu a 2-3 bodov v rozmedzí 3-9 mmol / l denne a zostavenie úplného kalibračného plánu len pri zmene činidiel alebo úpravách postupu.

Metóda glukózovej oxidázy na stanovenie glukózy

Metóda glukózooxidázy sa používa na stanovenie koncentrácie glukózy výlučne v rôznych telesných tekutinách. Výhodou tohto testu je jeho presnosť. Diagnostika, na rozdiel od rýchlych metód, umožňuje odhaliť množstvo čistého glukózy bez fruktózy a iných cukrov. Princípom tejto reakcie je sfarbenie roztoku, ktorý sa vyskytuje v dôsledku interakcie oxidačných činidiel so špecifickými farbivami. Hodnotenie výsledkov výskumu sa uskutočňuje metódou kolorimetrie a porovnaním so štandardnými roztokmi.

Kedy je predpísaná metóda glukózooxidázy?

Tento test sa používa na zistenie zhoršenia tolerancie cukru a vývoja pre-diabetes, ako aj vo výške ochorenia. Analýza sa zriedka používa na takéto účely, je to kvôli jej vysokým nákladom a dlhému čakaniu na výsledok. Najčastejšie sa stanovenie glukózy v krvi a moči pomocou tejto metódy používa pri diferenciálnej diagnostike ochorení, ako sú:

syndrómu intolerancie laktózy;
intolerancia fruktózy;
uvoľňovanie fruktózy z telesných tekutín;
zvýšená koncentrácia pentózy v moči.

Nepochybná výhoda testu glukózooxidázy je jeho presnosť.

Aký je základ tejto metódy?

Existujú rôzne metódy na stanovenie koncentrácie glukózy v krvi, ale glukózooxidáza je najpresnejšia. Spodná línia spočíva v tom, že interakcia cukru s kyslíkom vo vzduchu oxiduje činidlo. Do roztoku sa uvoľňuje peroxid vodíka. Táto látka interaguje s ortotoluidínom a tvorí farebnú zlúčeninu. Chovanie tejto reakcie si vyžaduje prítomnosť špeciálnych enzýmov. V oxidačnej reakcii musí byť prítomná glukózaoxidáza a pri farbení tekutiny peroxidáza. Intenzita farby roztoku bude závisieť od obsahu glukózy a bude najvyššia s vysokým obsahom.

Podstata metódy glukózooxidázy na stanovenie glukózy

Vyhodnotenie výsledku sa uskutoční použitím kvantitatívnej metódy fotometrie v rovnakom časovom intervale. Uistite sa, že používate kalibračný roztok, ktorý obsahuje určitú rýchlosť cukru, a od toho môžete zistiť koncentráciu glukózy v telových tekutinách, často v krvi.

Ako sa vykonáva analýza?

Materiál sa odoberie z pacienta na prázdny žalúdok. Na test s venóznou krvou v množstve 5 ml. V predvečer diagnózy je pacientovi preukázaná prísna diéta. To umožní posúdiť spoľahlivosť výsledku a vylúčiť prípadné chyby analýzy. 2 dni pred odobratím krvi sa pacient musí vzdať zlých návykov pitia a fajčenia. Je tiež potrebné obmedziť príjem nadmerne sladkých jedál a, ak je to možné, vyhnúť sa stresovým situáciám.

Najčastejšie je táto metóda stanovenia koncentrácie glukózy vykonávaná centrifugáciou, ktorá sa používa na oddelenie tvarových prvkov. Množstvo cukru sa stanoví v plazme. Po pridaní všetkých potrebných reagencií sa farba po 20 minútach pozoruje, ak sa test vykonáva pri izbovej teplote. Výpočet hladiny glukózy sa uskutočňuje podľa kalibračného plánu alebo pomocou pravidla pre dávky.

Reagencie pre výskum

Na stanovenie cukru je najvýhodnejšie použiť rýchle metódy na stanovenie glukózy v krvi. Dôvodom je ľahké používanie a rýchle výsledky. Okrem toho pacient nemusí chodiť do laboratória alebo nemocnice. Ale na rozdiel od testu glukózooxidázy, takáto diagnóza je nespoľahlivá. Pretože nerozlišuje glukózu od ostatných cukrov a určuje ich koncentráciu spoločne.

Základom reakcie glukózooxidázy je 9% roztok chloridu sodného a 50% síran zinočnatý. Pridávajú sa vo fáze krvného odstreďovania. Okrem toho použite tlmivý roztok s kyselinou octovou a octanom sodným. Titračná metóda určuje jeho pH na 4,8. Potom sa pridá glukózooxidáza, ktorá spôsobuje peroxid vodíka a peroxidázu, ktorá sa zúčastňuje farbenia roztoku na požadovanú koncentráciu, aby sa získal presný výsledok.

Normy počas analýzy

Množstvo cukru sa meria v špeciálnych jednotkách - milimolov na liter roztoku.

Krvné testy glukózovej oxidázy sa musia vykonať s prázdnym žalúdkom a na to sa používa plazma alebo sérum. Miera jej počtu pre dospelých pre ženy aj pre mužov je 3,3 - 5,5. Pre deti vo veku do 15 rokov je tento údaj mierne nižší a pohybuje sa medzi 3,2 a 5,3. U novorodencov je hladina glukózy v krvi 1,7-4,2. Zvýšenie výkonnosti sa pozoruje pri vývoji pacienta s diabetes mellitus alebo porušení glukózovej tolerancie. Táto podmienka je prediabetes, a ak nie je liečená včas, potom čoskoro povedie k rozvoju tejto závažnej patológie.

PRACOVNÉ ČÍSLO 1. KVANTITATÍVNE STANOVENIE GLUKÓZY V KRVI. ENZYMATICKÁ (GLUKOSOOXIDÁLNA) METÓDA

ODÔVODNENIE PRE VÝKON PRÁCE. Stanovenie glukózy v krvi alebo v plazme sa vykonáva u každého pacienta pre posúdenie stavu metabolizmu sacharidov a diagnostické patológia (hyperglykémia, hypoglykémia). Pre stanovenie hladiny glukózy v krvi za použitia enzymatické metódy založené na oxidáciu glukózy oxidázy glukózy na kyselinu glukónovú v prítomnosti vzdušného kyslíka. Metóda je vysoko špecifická na stanovenie D-glukózy v prítomnosti iných redukčných látok obsiahnutých v tkanivových extraktoch a biologických tekutinách.

PRINCÍP METÓDY. Glukózová oxidáza je komplexný enzým obsahujúci FAD ako protetickú skupinu. Keď sa glukóza oxiduje glukózooxidázou, oddeľujú sa dva atómy vodíka z prvého atómu uhlíka v molekule glukózy. Ďalej sa tieto dva atómy vodíka prenesú do FAD, čím sa vytvorí FADH₂. Ten druhý prenáša atómy vodíka na molekulárny kyslík za vzniku H₂ach₂. Potom H₂ach₂ je štiepený enzýmom peroxidázy do vody a atómového kyslíka, ktorý oxiduje chromogén (farbivo), ktorý sa počas oxidácie stáva sfarbený.

Metóda glukózovej oxidázy

V súčasnosti sa najčastejšie používajú metódy založené na použití enzýmu glukózooxidázy. Metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

Glukózová oxidáza katalyzuje prenos dvoch atómov vodíka z prvého atómu uhlíka glukózy na kyslík rozpustený v kvapalnom reakčnom činidle. V priebehu reakcie sa peroxid vodíka tvorí v ekvimolárnych množstvách. tj koncentrácia vytvoreného peroxidu vodíka sa presne rovná určenej koncentrácii glukózy. V dôsledku toho je použitie glukózy oxidázy reakcie, transformovanej úloha stanovenie koncentrácie glukózy v úlohe stanovenie koncentrácie peroxidu vodíka, ktorá, ako bude uvedené nižšie, je oveľa jednoduchšie prvý. A tu je niekoľko metód, ktoré sa v laboratórnej praxi dnes široko používajú (pozri schému).

Medzi vyššie uvedené metódy záznamu najčastejšie fotometrické biochemických metód, v ktorých molekuly peroxidu vodíka enzýmom peroxidáze štiepi za vzniku aktívnej formy kyslíka - superoxidové anión radikál - O₂ -, čo následne oxiduje chromogén, čo vedie k významnej zmene absorpčného spektra chromogénu.

Vysoká popularita tejto metódy na stanovenie glukózy je spôsobená jej vysokou špecifickosťou a jednoduchou implementáciou. Metóda môže byť realizovaná pomocou bežného fotometra, ako aj pomocou automatických biochemických autoanalyzátorov.

Metóda glukózooxidázy sa dnes uznáva ako jedna z najpresnejších kvantitatívnych metód na stanovenie glukózy. Ako biologický materiál sa používa ako sérum a celá krv. Pri práci s ním je potrebné brať do úvahy skutočnosť, že zachytenie podielu kapilárnej krvného séra (plazma) závisí na hematokritu, čo môže mať nepriaznivý vplyv na presnosť výsledku. Preto je pri určovaní glukózy vyššie opísaným spôsobom výhodné použiť sérum pacienta.

Spolu s fotometrickou metódou koncového bodu sa pred niekoľkými rokmi objavili zostavy, v ktorých bola implementovaná kinetická fotometrická metóda. Spôsob spočíva v tom, že v určitom pomere oxidázy glukózy a aktivity peroxidázy, rýchlosť tvorby farebných látok na nejakú dobu po pridaní vzorky do pracovného roztoku bude úmerná koncentrácii glukózy vo vzorke. Výhodou tejto metódy je to, že výsledok nie je závislá na prítomnosti iných zlúčenín vo vzorke, pretože absorpcia posledne je stabilný v čase. Táto metóda vyžaduje použitie kinetického fotometra, poloautomatických analyzátorov alebo automatických biochemických analyzátorov. Meranie koncentrácie glukózy v krvi sa vykonáva účelne za pomoci zariadení, ktoré sú založené na amperometrickej meracom princípe, pomocou špeciálnych senzorov enzýmov. Peroxid vodíka je mimoriadne nestabilná chemická zlúčenina a môže slúžiť ako zdroj nabitých častíc. To je to, čo sa používa v senzoroch enzýmov typu membrány alebo v elektrochemických prvkoch prenosných glukometrov.

Na záver by sme mali spomenúť nevýhody metódy glukózooxidázy. Vzniknutý peroxid vodíka a superoxidové radikál anión nielen môže oxidovať chromogén, ale ostatné látky prítomné v biologickej tekutine: kyselina askorbová, kyselina močová, bilirubínu. V tomto prípade, podľa toho, je podiel peroxidu, ktoré sa zúčastňujú pri oxidácii chromogénu sa znižuje, čo vedie k podhodnoteniu výsledku glukózy. Táto metóda je lineárna, spravidla do 20-30 mmol / l glukózy.

Kvantitatívne stanovenie glukózy v krvi metódou glukózooxidázy

Princíp metódy. Metóda je založená na špecifickosti pôsobenia enzýmu glukózooxidázy. Tento enzým oxiduje glukózu v prítomnosti molekulového kyslíka za vzniku glukonolaktónu, ktorý sa spontánne hydrolyzuje na kyselinu glukónovú. Glukózová oxidáza oxiduje glukózu za vzniku peroxidu vodíka (H.₂ach₂), ktorý pod pôsobením peroxidázy reaguje s 4-aminoantipyrínom a fenolom. Výsledkom je zlúčenina ružovej farby, ktorej optická hustota pri 510 nm je úmerná koncentrácii glukózy vo vzorke.

2 N₂ach₂ + 4-aminoantipyrín + fenol → chinónimín + 4H₂ach

vybavenie: KFK, odstredivka, termostat, trojnožky, skúmavky, pipety, biologický materiál, činidlá obsiahnuté v pracovnom roztoku.

skúšobná vzorka, ml

štandardná vzorka, ml

jeden test (N₂O), ml

Kalibračný roztok glukózy (štandardný)

Skúmavky boli inkubované v termostate pri teplote 37 ° C počas 15 minút, potom sa UFC kolorimetriruyut na u zeleného svetla filtra v bunkách s hrúbkou vrstvy 5 mm proti blanku (H₂O). Ružová farba je stabilná 1 hodinu po inkubácii.

kalkulácie obsah glukózy produkovaný vzorcom:

C = x C štandard, kde

C je obsah glukózy v experimentálnej vzorke, mol / l;

Eop je optická hustota vzorky;

Est je optická hustota kalibračnej vzorky;

С стандарт - съдържание в калибрационния разтвор, mol / l.

Normálne hodnoty:  novorodenci - 2,8-4,4 mmol / l

 deti - 3,9 - 5,8 mmol / l

 dospelí - 3,9 - 6,2 mmol / l

Hypoglykémia (HGH). Zvýšenie hladiny glukózy v krvi je spôsobené mnohými dôvodmi, podľa ktorých existujú dve skupiny hyperglykémie.

1. Insulárny - spojený s nedostatočným obsahom inzulínu alebo neúčinnosťou jeho účinku.

2. Extrazulárne (extrazulárne) - nezávisia od účinku inzulínu.

Nasledujúce postupy sú najvýznamnejšie pri tvorbe HGH: zvýšenie rozpadu glykogénu; zvýšená neoglukogenéza; inhibícia syntézy glykogénu; zníženie využitie glukózy tkanivami pod vplyvom antagonistov inzulín hormónov: rastového hormónu, glukokortikoidy, tyroxín, thyrotropin.

Potravinová hyperglykémia sa zaznamenáva pri nadmernej dodávke glukózy v krvi (napríklad hyperglykémia pri zaťažení cukrom). "Hepatálna" hyperglykémia sa vyskytuje v difúznych léziách pečene.

Pretrvávajúca a závažná hyperglykémia najčastejšie sprevádza diabetes mellitus. Prijímané poskytnúť cukrovka závislá na inzulíne a cukrovka závislá na inzulíne, alebo, v tomto poradí, diabetes typu I a diabetes typu II. Tvorba diabetes mellitus typu I sa spája predovšetkým so zhoršenou syntézou a výmenou inzulínu.

Druhá skupina hyperglykémie je primárne spojená s hyperfunkciou endokrinných žliaz, ktoré produkujú hormóny - antagonisty inzulínu. To je pozorované u ochorenia, ako je syndróm a Cushingovho choroba, akromegália, hypertyreóza, feochromocytóm, glyukoganoma. Hladina glukózy v krvi zvýšená a v určitých pečeňových chorôb (najmä 10 až 30% pacientov s cirhózou pečene), hemochromatóza (pigment cirhóza, diabetes bronz).

Hypoglykémia (HGP) - pokles hladiny glukózy v krvi - najčastejšie spojený s absolútnym alebo relatívnym zvýšením hladiny inzulínu v krvi. Vnepankreaticheskim hypoglykémia pozorovať v dôsledku nerovnováhy medzi rozsahom procesmi glykogenolýzy a glukoneogenézy v pečeni počas akútna a chronická hepatitída, cirhóza, akútna a subakútna ochorenie pečene, intoxikácia alkoholom, otravy arzénom, fosforu, pri dlhšom mechanické žltačky, kongestívne pečene, primárna alebo metastatické rakoviny pečene, Zníženie koncentrácie glukózy v krvi sú často pozorované u pacientov s rakovinou pažeráka a ďalších zhubných nádorov vnepankreaticheskim lokalizácia (fibróm, fibrosarkómu, neurom), rovnako ako nekontrolovateľné vracanie, anorexia, pečeňové diabetes, urémia, bohaté laktácie a glykozúria u tehotných žien.

Hypoglykémia môže mať ústredný pôvod v dôsledku mentálneho traumy, encefalitídy, subarachnoidálneho krvácania, mozgového nádoru.

1. dedičné poruchy trávenia uhľohydrátov.

2. Aké typy hyperglukózy sú známe?

3. Aké sú príčiny patologickej hyperglukózy?

4. Aká je príčina inzulín-dependentného diabetes mellitus?

5. Aké sú biochemické príčiny dedičných ochorení: a) glykogenóza? b) aglykogenéza? c) fruktóza; d) galaktozémia?

6. Aké sú biochemické zmeny metabolizmu uhľohydrátov počas pôstu?

7. Princíp metódy stanovenia tolerancie glukózy.

Metódy glukózovej oxidázy a hexokinázy na stanovenie sérovej glukózy v krvi

Presná diagnóza, predpísaná liečba si vyžaduje sériu laboratórnych testov.

Metóda stanovenia sérovej glukózy je najdôležitejším nástrojom na detekciu hyper- a hypoglykémie u pacientov s diabetes mellitus.

Metóda umožňuje upraviť metabolické poruchy liečivých údajov. Diagnostické hladiny glukózy môžu byť stanovené aj v plnej krvi a plazme.

Metódy na stanovenie glukózy v krvi

Metódy na určenie množstva glukózy v krvi sa vyvinuli veľa.

Niektoré z nich (redukometrické, kolorimetrické) sa prakticky nepoužívajú z dôvodu vysokej toxicity a nízkej presnosti výsledkov.

Najbežnejšie používané štúdie enzýmov. Metóda glukózooxidázy je metóda farebnej reakcie, ktorá sa vyskytuje pri zahrievaní uhľohydrátov. Hexokináza určuje aktivitu krvi na hexokináze.

Metóda glukózovej oxidázy

Metóda glukózooxidázy na určenie hladiny glukózy v krvi je založená na jej oxidačnej reakcii pod vplyvom enzýmu. To vytvára peroxid vodíka, farbia látku Chromogen, ktorej koncentrácia určuje množstvo glukózy.

Metóda glukózooxidázy sa používa na:

dedičná intolerancia fruktózy;
pentosuria;
laktulóznej intolerancie.

Nevýhodou štúdie je, že peroxid vodíka je schopný oxidovať ako chromogén, tak aj askorbický, kyselinu močovú a bilirubín prítomné v krvi. Vypočítajte množstvo glukózovej fotometrickej metódy, intenzita farbenia sa porovnáva s kalibračným grafom.

V laboratórnych podmienkach možno určiť hladinu látky:

v žilovej krvi. Používajú sa automatické analyzátory;
v kapilárnej krvi. Plot sa vykonáva z prsta.

Elektrochemická metóda pozostáva z použitia elektród obsahujúcich glukózooxidázu. Množstvo vytvoreného peroxidu vodíka alebo zvyšná hladina kyslíka spotrebovaného počas oxidačného procesu sa stanoví.

Hexokinázová metóda

Látka je najdôležitejším enzýmom metabolizmu glukózy, ktorý obmedzuje rýchlosť procesu v bunkách.

V laboratórnych podmienkach sa pod pôsobením hexokinázy glukóza fosforyluje adenozín trifosfátom.

V dôsledku reakcie sa vytvárajú organické molekuly, ktorých množstvo je určené úrovňou absorpcie svetla v ultrafialovej zóne. Príliš rýchla pozitívna reakcia hexokinázy môže byť tiež znakom výskytu malígnych nádorov.

Príprava na analýzu

Skúšky glukózy v krvi sú predpísané pre:

Pred analýzou musíte dodržať niekoľko podmienok, aby boli výsledky čo najspoľahlivejšie:

výskum sa vykonáva prázdnym žalúdkom. Materiál odobraný ráno;
niekoľko dní pred diagnózou je potrebné vyhnúť sa ťažkej fyzickej námahe, stresu;
V dennej strave pacienta musí byť aspoň 150 gramov sacharidov. Pri nedostatku sa hladina glukózy zvýši a pomaly klesá, čo deformuje analýzu údajov.
deň pred diagnózou nemôže fajčiť a piť alkoholické nápoje;
nie je možné vykonávať výskum po ťažkých operáciách, pôrode, za prítomnosti zápalu. Kontraindikované pri analýze cirhózy pečene, exacerbácie ochorení žalúdka, nádorových procesov;
niekoľko dní pred štúdiom by sa nemali podstúpiť fyzioterapeutické postupy, užívať perorálne kontraceptíva, diuretiká, psychotropné lieky, kofeín.

Analýza môže poskytnúť falošne pozitívny výsledok v hypokaliémii a endokrinných ochoreniach (Cushingov syndróm, tyreotoxikóza).

Normy glukózy v krvnom sére podľa veku

Normálne ukazovatele závisia od veku:

pupočná krv môže obsahovať od 2,5 do 5,3 mmol / l;
u predčasne narodených detí - od 1,1 do 3 mmol / l;
deti prvého dňa života - od 2,22 do 3,33;
vo veku 2,7 až 4,4;
u detí vo veku nad 6 rokov - od 3,3 do 5,5 mmol / l;
u dospelých do 60 rokov - od 4,4 do 6,3;
u starších pacientov - od 4,6 do 6,1 mmol / l.

Hypoglykémia u dospelých je diagnostikovaná s hodnotami glukózy nižšou ako 3,3 mmol / l a hyperglykémiou - viac ako 6,1 mmol / l.

Metóda glukózovej oxidázy na stanovenie glukózy v plazme

Sme radi, že Vás privítame na stránke www.unimedao.ru!

Ďakujem za odpoveď na našu otázku.

19.11.2009

Gerasimenko V.A., Ph.D., Kurilyak O.A., Ph.D.

Z archívu novín "News A / O Unimed"

Určenie koncentrácie glukózy v krvi je jednou z najčastejšie vykonávaných biochemických štúdií v QDL. Dôvodom výnimočnej popularity testu je spojená s vysokým výskytom cukrovky. Tento test sa vykonáva na ambulanciách aj ambulanciách. Pacienti s cukrovkou sú nútení skúmať hladinu glukózy v krvi doma, pretože bez týchto informácií je pre nich ťažké upraviť stravu, výkon, používanie inzulínu a iných antidiabetických liekov. Výnimočný význam testu a veľké objemy vykonaného výskumu stimulovali vývojárov k tomu, aby vytvorili rôzne typy zariadení a metódy na stanovenie koncentrácie glukózy v krvi.

V súčasnosti existuje veľa metód na stanovenie glukózy. Môžu byť klasifikované nasledovne.

Metódy na stanovenie glukózy v sére

- fotometrický koncový bod

- reflexná fotometria - suchá chémia

Prvé dve metódy sú mimoriadne nepríjemné, toxické a majú nízku presnosť, takže na ne nebudeme.

Metóda glukózovej oxidázy

V súčasnosti sa najčastejšie používajú metódy založené na použití enzýmu glukózooxidázy. Metóda je založená na nasledujúcej reakcii:

Na obr. Obrázky 1 a 2 ukazujú spektrá pracovného roztoku pred a po pridaní štandardného roztoku glukózy. Maximálna absorpcia reakčnej zmesi - (činidlo + glukóza) je v oblasti 500 nm. Preto zmena optickej hustoty konečnej reakcie pri vlnovej dĺžke 480-520 nm je úmerná koncentrácii glukózy obsiahnutej vo vzorke.

Vysoká popularita tejto metódy na stanovenie glukózy je spôsobená jej vysokou špecifickosťou a jednoduchou implementáciou. Metóda môže byť realizovaná pomocou bežného fotometra (lepšie ako špecializovaný biochemický fotometer ako je Mikrolab 540) alebo pomocou automatických biochemických autoanalyzátorov.

Spolu s fotometrickou metódou koncového bodu sa pred niekoľkými rokmi objavili zostavy, v ktorých bola implementovaná kinetická fotometrická metóda. Spôsob spočíva v tom, že v určitom pomere oxidázy glukózy a aktivity peroxidázy, rýchlosť tvorby farebných látok na nejakú dobu po pridaní vzorky do pracovného roztoku bude úmerná koncentrácii glukózy vo vzorke. Výhodou tejto metódy je to, že výsledok nie je závislá na prítomnosti iných zlúčenín vo vzorke, pretože absorpcia posledne je stabilný v čase. Táto metóda vyžaduje použitie kinetického fotometra, napríklad Stat Fax 1904+, Stat Fax 3300, poloautomatické analyzátory, ako je Clima 15 alebo automatické biochemické analyzátory. Meranie koncentrácie glukózy v krvi sa vykonáva účelne za pomoci zariadení, ktoré sú založené na amperometrickej meracom princípe, pomocou špeciálnych senzorov enzýmov. Peroxid vodíka je mimoriadne nestabilná chemická zlúčenina a môže slúžiť ako zdroj nabitých častíc. To je to, čo sa používa v senzoroch enzýmov typu membrány alebo v elektrochemických prvkoch prenosných glukometrov.

Vzorka celej krvi (zvyčajne 20 μl) sa zriedi systémovým tlmivým roztokom (červené krvinky sú zničené) a potom sa vedú cez linku do prietokovej bunky. Glukóza podlieha oxidácii pod vplyvom enzýmu glukózooxidázy umiestnenej na membráne. Výsledný peroxid vodíka difunduje cez membránu a je ďalej oxidovaný v katalytickej reakcii za pôsobenia platiny. Difúzia peroxidu vodíka na povrchu platiny tvorí prúd proporcionálny k počtu molekúl H₂ach₂. Takto získaný signál je spracovávaný zariadením pri zodpovedajúcej hodnote napätia. Táto nameraná hodnota je úmerná koncentrácii glukózy vo vzorke.

Ako príklad nástrojov používajúcich metódu opísanú vyššie, môžeme spomenúť analyzátory glukózy Biosen (Nemecko). Tieto zariadenia sú vhodné nielen v nemocniciach, ale aj v polyklinikách, kde sa testovanie glukózy vykonáva hlavne z kapilárnej krvi.

Dôležitým krokom vo vývoji klinických laboratórnych diagnostických metód bol vznik "suchého chémia". Prirodzene, jednou z prvých aplikácií tejto technológie bola úloha stanovenia glukózy v krvi pacienta. Prvé zariadenia boli v porovnaní s tradičnými metódami laboratórneho výskumu výrazne nižšie. V priebehu času sa však niekoľkým firmám podarilo vyvinúť také diagnostické pásiky a reflexné fotometre, ktoré poskytli veľmi vysokú presnosť analýzy. Jednodotykové glukomery a testovacie prúžky Life Scan (USA) sú veľmi populárne po celom svete a úspešne kombinujú analytickú presnosť kvantitatívnej enzymatickej metódy s rýchlosťou a jednoduchosťou "suchého chémia".

Merače glukózy v krku One Touch sú navrhnuté tak, aby rýchlo a presne merali hladiny glukózy v celej krvi. Testovací prúžok One Touch obsahuje všetky potrebné chemické zložky pre dvojstupňovú metódu glukózooxidázy, vrátane enzýmov glukózooxidázy a peroxidázy, ktoré sú adsorbované na jedinečnú poréznu hydrofilnú membránu. Výsledkom reakcie je tvorba farebného komplexu. Intenzita rozvinutej farby sa zaznamená pomocou reflexného minifotometra.

Membránový testovací prúžok One Touch pripomína špongiu s mikroskopickými pórmi a vykonáva trojitú funkciu. Účinkuje: 1) ako zásobník, zhromažďovanie potrebného množstva krvi, 2) ako filter, blokujúci pevný bunkový materiál (erytrocyty, leukocyty atď.), 3) ako hladký optický povrch, na ktorom sa odráža odrazené svetlo. Táto funkcia je obzvlášť dôležitá pre fungovanie zariadenia. Umožňuje čítať spodnú časť pásika, zatiaľ čo krv zostáva na hornej časti testovacieho prúžku. Preto nie je potrebné pranie (pranie) krvi z povrchu testovacieho prúžku.

Okrem toho membrána má hydrofilné vlastnosti, kvôli ktorému kvapka krvi "priťahuje" na povrch testovacieho prúžku, keď sa dotýka.

Prístroj One Touch obsahuje dve špeciálne LED diódy. Spracovanie vyvíjanej farby na testovacom prúžku je nasledovné. Akonáhle sa testovací prúžok vloží do zariadenia, dôjde k nulovému odpočtu. V tomto okamihu na displeji vidíme: "Počkaj". Keď sa na testovací prúžok aplikuje kvapka krvi, krvná plazma je okamžite sorbovaná membránou, zatiaľ čo erytrocyty a nadbytočná plazma zostávajú na povrchu membrány. Po úplnej absorpcii kvapky krvi okamžite nastane farbenie. Zariadenie zaznamená zmenu veľkosti odrazu a automaticky spustí časovač. Po 45 sekundách sa chemická reakcia skončí, výsledok odrazu svetla sa spracuje. Farebný reakčný produkt absorbuje svetlo vyžarované prvou LED. Krvné bunky a nadbytočná plazma absorbujú aj svetlo vyžarované diódou. Na korekciu odrazu pozadia sa druhé čítanie uskutočňuje druhou LED s rôznou vlnovou dĺžkou. Rozdiel medzi signálmi z prvej a druhej diódy LED obsahuje informáciu o absorpcii svetla chromogénom. Signál získaný z chromogénu na odhad koncentrácie glukózy koreluje so špeciálnou kalibráciou. Všetky zariadenia One Touch sa kalibrujú pomocou referenčnej metódy na laboratórnom analyzátore glukózy. Týmto postupom sa získa štandardná kalibračná krivka. Treba poznamenať, že je dosť ťažké stanoviť výrobu testovacích prúžkov, ktoré by boli úplne rovnaké chemicky, vzhľadom na veľmi nízku koncentráciu činidiel. Na vyriešenie tohto problému sa používa štandardná kalibračná krivka pozostávajúca z 16 kalibračných línií. Kontrola kvality sa vykonáva bezprostredne po výrobe testovacích prúžkov, čo umožňuje určiť, ktoré z kalibračných línií (od 1 do 16) sa môžu použiť na tento testovací prúžok. Toto je tzv. Kódové číslo, ktoré je pripevnené k baleniu testovacích prúžkov. Tieto 16 kalibračných čiar je tiež naprogramované v mikroprocesorovom prístroji. Ak chcete dosiahnuť optimálne presné výsledky, kódové číslo uvedené na balení testovacieho prúžku sa nastaví v zariadení pomocou tlačidla s kódom. Tak nesprávne nainštalovaný kód na prístroji môže spôsobiť chybu merania.

Od nástupu zariadení One Touch na trhu prešiel veľký počet klinických štúdií v laboratóriách Ruska, Ameriky a Európy. Jeden z takýchto štúdií uskutočnil Endokrinologické vedecké centrum Ruskej akadémie lekárskych vied na žiadosť Ruskej asociácie diagnostiky lekárskej laboratórií. Špecialisti strediska vykonali komparatívnu analýzu dvoch metód merania hladín glukózy v krvi. Výsledky získané pri One Touch boli porovnané s údajmi získanými na biochemickom analyzátore Spectrum II (Abbott Laboratories, USA), ktorý implementuje hexokinázovú metódu na stanovenie glukózy. Bolo vyšetrených 190 vzoriek krvi od 95 pacientov. Korelačný koeficient výsledkov bol 0,988641. Variačný koeficient v normálnych a patologických rozsahoch na zariadení One Touch nepresahuje 2,5%.

Oficiálna správa Centra Endokrinologického výskumu Ruskej akadémie lekárskych vied povedala: "Jednodotykové zariadenia majú vysokú presnosť a presnosť, ako aj širokú škálu meraní. Môžu byť použité na diagnostikovanie havarijných stavov u diabetu, vrátane núdzových tímov, pretože tieto zariadenia sú nielen spoľahlivé, ale aj rýchlo produkujú výsledky. "

Hexokinázová metóda

Registrácia sa uskutočňuje pri absorpcii NADH pri vlnovej dĺžke 340 nm. Táto metóda je vysoko špecifická a nereaguje s inými zložkami krvného séra. Metóda hexokinázy sa považuje za referenciu pre stanovenie glukózy. Zvyčajne je lineárny až 50 mmol / l, čo mu umožnilo širokú podporu pre kliniky s endokrinologickými oddeleniami.

Z popísanej rôznorodosti metód na stanovenie glukózy môžu zamestnanci QDL samy rozhodnúť o tom, ktorá metóda určenia a ktoré zariadenie si vyberiete:

Metódy "mokrej" biochémie, implementované na automatických biochemických analyzátoroch, poskytnú laboratóriám veľký tok analýz.
Analyzátory glukózy typu Biosen vyžadujú od prevádzkovateľa minimálne úsilie, pretože sú plne automatizované a dostatočne produktívne (rýchlosť od 50 do 200 vzoriek za hodinu).
Pre laboratóriá s malým počtom štúdií, ako aj pre expresné laboratóriá je vhodný špecializovaný biochemický fotometer Mikrolab 540.
Pre pomocné tímy skryje pomoc je dokonalé riešenie - glukomery glukózy, ako napríklad One Touch.

Takže úloha QDL zabezpečiť nielen rýchle, ale aj vysoko presné stanovenie glukózy je dnes plne riešiteľná.

Krvná glukóza, moč, tekutina

Krvná glukóza je prísne kontrolovaná.

Kontrola koncentrácie glukózy v krvi sa vykonáva nervovými vplyvmi a hormónmi.

Nervová regulácia

Nervová regulácia koncentrácie glukózy v krvi sa prejavuje pozitívnym účinkom n.vagusu na sekréciu inzulínu a inhibičným účinkom sympatického inervovania na tento proces. Okrem toho uvoľňovanie adrenalínu do krvi podlieha sympatickým vplyvom.

Hormonálna regulácia

Hlavné hormonálne regulačné faktory sú glukagón, adrenalín, glukokortikoidy, somatotropný hormón na jednej strane a inzulín na druhej strane. Všetky hormóny okrem inzulínu ovplyvňujúce pečeň zvyšujú glykémiu.

Inzulín je jediný hormón v tele, ktorý je zameraný na zníženie hladiny glukózy v krvi. Svojím vplyvom je glukóza silne absorbovaná svalmi a tukovým tkanivom.

Pokles koncentrácie glukózy v krvi inzulínom sa dosahuje nasledujúcimi spôsobmi:

prechod glukózy do buniek - aktivácia transportných proteínov GluT4 na cytoplazmatickej membráne,
účasť glukózy na glykolýze - zvýšenie syntézy glukokinázy, enzýmu nazývaného pasce na glukózu, stimuláciu syntézy iných kľúčových enzýmov glykolýzy - fosfofruktokranázu, pyruvátkinázu,
zvýšená syntéza glykogénu - aktivácia glykogénsyntázy a stimulácia jej syntézy, ktorá uľahčuje premenu prebytočnej glukózy na glykogén,
aktivácia dráhy pentózafosfátu - indukcia syntézy glukózo-6-fosfátdehydrogenázy a 6-fosfoglukonátdehydrogenázy,
zvýšená lipogenéza - zapojenie glukózy do syntézy triacylglycerolov alebo fosfolipidov.

Mnohé tkanivá sú úplne necitlivé na účinok inzulínu, nazývajú sa inzulínovo nezávislé. Tieto zahŕňajú nervové tkanivo, sklovité telo, šošovky, sietnicu, glomerulárne obličkové bunky, endotelové bunky, semenníky a červené krvinky.

Glukagón zvyšuje hladinu glukózy v krvi:

zvýšenie mobilizácie glykogénu prostredníctvom aktivácie glykogén fosforylázy,
stimulácia glukoneogenézy - zvýšenie aktivity enzýmov pyruvát karboxylázy, fosfoenolpyruvát karboxykinázy, fruktózy-1,6-difosfatázy.

Adrenalín spôsobuje hyperglykémiu:

aktivácia mobilizácie glykogénu - stimulácia glykogén fosforylázy,

Glukokortikoidy zvyšujú hladinu glukózy v krvi

potlačením prechodu glukózy do bunky,
stimulácia glukoneogenézy - zvýšenie syntézy enzýmov pyruvát karboxylázy, fosfoenolpyruvát karboxykinázy, fruktózy-1,6-difosfatázy.

V tabuľke sú zhrnuté hlavné aspekty hormonálnych vplyvov:

Aktivácia glykogenolýzy v pečeni;
Stimulácia glukoneogenézy;

Zvýšená glukoneogenéza;
Znížená membránová priepustnosť glukózy.

Klírens glukózy v klinickej praxi

Viac ako 90% všetkých rozpustných nízkomolekulárnych krvných sacharidov je glukóza; Okrem toho môžu byť v malých množstvách prítomné fruktóza, maltóza, manóza a pentóza av prípade patológie galaktóza. Spolu s nimi v krvi obsahuje polysacharidy spojené s proteínmi.

Obzvlášť intenzívne je glukóza spotrebovaná a používa sa na rôzne potreby tkaniva centrálneho nervového systému, červených krviniek, medulla obličiek. Pri prechodnom metabolizme sa glukóza používa na tvorbu glykogénu, glycerolu a mastných kyselín, aminokyselín, kyseliny glukurónovej a glykoproteínov. Koncentrácia glukózy v krvi je derivátom glykolýzy a oxidácie trikarboxylových kyselín v cykle TCA, glykogenéze a glykogenolýze v pečeni a svalovom tkanive, glukoneogenéza v pečeni a obličkách a príjem glukózy z čreva.

V klinickej praxi sa obvykle vyšetrujú hladiny glukózy v krvi, koncentrácia iných cukrov a glykogénu sa používa omnoho menej často. V ľudskej krvi je glukóza pomerne rovnomerne rozdelená medzi plazma a tvorené elementy a bolo stanovené, že obsah cukru v venóznej krvi je 0,25-1,0 mmol / l (v priemere o 10%) menej ako v arteriálnej a kapilárnej krvi. Definícia kyseliny mliečnej a pyrohroznovej, aktivita mnohých enzýmov metabolizmu uhľohydrátov, kyseliny sialovej a hexurónovej, serumukoidov, glykozylovaného hemoglobínu a ďalších indikátorov má známu diagnostickú hodnotu.

Obsah glukózy v moči závisí od jej koncentrácie v krvi, hoci sa vylučuje ako normálnou tak aj zvýšenou hladinou cukru v krvi. S nárastom koncentrácie glukózy v krvi sa prekoná takzvaná obličková prahová hodnota (u zdravých ľudí leží v oblasti 8,3-9,9 mmol / l) a dochádza ku vzniku glukozúrie. Pri arteriosklerotických obličkách s diabetom sa prah zvyšuje a glukozúria sa nemusí zaznamenať ani pri zvýšení koncentrácie glukózy na 11,0-12,1 mmol / l.

Metódy na stanovenie glukózy v krvi

Metódy na stanovenie krvnej glukózy sú rozdelené do troch skupín: redukcia, kolorimetrická a enzymatická.

Redukčné metódy (Je potrebné mať na pamäti, že metódy tejto skupiny dávajú nadhodnotené výsledky (asi o 20-25%), pretože krv obsahuje množstvo zlúčenín, ktoré nesúvisia so sacharidmi, ale majú redukujúce vlastnosti (kyselina močová, glutatión, kreatinín, kyselina)):
- Hagingorn-Jensenova titrometrická metóda je založená na vlastností cukru na obnovenie varenia v alkalickom prostredí draselných solí železo-sínus a železo-sludinát. Podľa stupňa tohto oživenia sa koncentrácia cukru v krvi skúma pomocou titrometrie. Dôležitou výhodou metódy sú jej nízke náklady a možnosť použitia v akejkoľvek laboratóriu;
- na základe redukcie nitrobenzénov, napríklad kyseliny pikrovej na kyselinu pikramovú;
- metóda založená na schopnosti glukózy redukovať soli medi. Výsledná monovalentná meď pôsobí ako medziprodukt. Oxidovaný vzdušným kyslíkom obnovuje kyselinu arzén-molybdénovú alebo kyselinu fosforovolfrámovú, ktoré slúžia ako konečný chromogén.
Kolorimetrické metódy. Patria medzi ne:
- Somodžiho metóda - redukčná reakcia medi, ktorá je v zložení medi-orthronového činidla, na oxid meďnatý. Táto metóda je pracovná, viacstupňová, nešpecifická a v súčasnosti sa prakticky nepoužíva;
- Folin-Wu metóda - redukcia vínanu meďnatého na oxid lítny. Metóda je jednoduchá, nevýhodou je nedostatok prísnej proporcionality medzi intenzitou získanej farby a koncentráciou glukózy;
- stanovenie koncentrácie glukózy podľa Morrise a Roe - dehydratácia glukózy pôsobením kyseliny sírovej a jej premena na oxymetylfurfural, ktorý kondenzuje s artronom na modrú zlúčeninu. Vyžaduje najčistejšie činidlá a prísne dodržiavanie konštantnej reakčnej teploty;
- Gultmanova ortotoluidínová metóda pri modifikácii Chivarinen-Nikkil, ktorá spočíva v určení intenzity farbenia roztoku, ku ktorému dochádza vtedy, keď aromatický amín ortotoluidín interaguje s aldehydovou skupinou glukózy v kyslom médiu. Táto metóda je presná a umožňuje presnejšie stanovenie glukózy.
- Anilínová metóda zachováva citlivosť ortotoluidínovej metódy, je však ešte špecifickejšia.
Enzymatické metódy:
- na základe hexokinázovej reakcie. Glukóza pod pôsobením hexokinázy je fosforylovaná ATP, výsledný Gl-6-F v prítomnosti dehydrogenázy obnovuje NADP. Množstvo tejto látky je určené zvýšením absorpcie svetla v ultrafialovej oblasti. Táto metóda je príliš drahá pre praktické laboratóriá.
- založené na oxidácii glukózy na kyselinu glukurónovú s použitím enzýmu glukózooxidázy a tvorbe počas reakcie peroxidu vodíka, ktoré (v rôznych verziách):
  - chemickými spôsobmi;
  - s účasťou peroxidázy, oxiduje bezfarebný ortotolidín, premenil ho na zeleno-modrej farby, priamosť farebnej závislosti na koncentrácii glukózy zostáva v rozmedzí od 1,1 do 22 mmol / l;
  - v prítomnosti fenolu za účasti peroxidázy, oxiduje 4-aminoantipyrín na farebnú karmínovú farbu;
  - v prítomnosti iónov medi, oxiduje fenolftaleín na fenolftaleín, ktorý je za alkalických podmienok červen farbený.
Elektrochemické metódy, ktoré používajú elektródy obsahujúce imobilizované enzýmy, najmä glukózooxidázu. Reakcia sa zaznamenáva množstvom vytvoreného peroxidu vodíka alebo stratou kyslíka spotrebovaného na oxidáciu glukózy.
Diagnostické pásy používajúce reakciu glukózooxidázy a peroxidázy a deriváty benzidínu ako chromogén.

Ako jednotné boli prijaté tri metódy: titrometrická metóda Haggedorn-Jensen, orto-toluidínová metóda a metóda o-tolidín-glukózooxidázy.

Stanovenie glukózy metódou ortotoluidínu

zásada

Glukóza pri zahrievaní ortotolúdom v prítomnosti kyseliny sírovej poskytuje modrozelenú farbu.