Technológia výroby inzulínu

Analýzy

Inzulín je jedným z hormónov, ktoré produkuje samotné ľudské telo, konkrétne pankreas. Porušenie sekrécie tejto látky vedie k vzniku takej vážnej choroby ako je diabetes. Na jeho liečbu pomocou syntetického hormónu, ktorý je dlhodobo izolovaný z pankreasu hospodárskych zvierat. Avšak technológia na výrobu inzulínu pomocou veľmi bežnej baktérie - Escherichia coli alebo kvasinkovou hubou sa už dlho používa. Použitie tejto metódy umožňuje vyhnúť sa alergickým reakciám spôsobeným cudzími proteínmi, ktoré majú malý rozdiel od človeka.

Technologická schéma

Výrobná technológia inzulínu zahŕňa všetky hlavné štádiá výroby biotechnologických výrobkov. Výsledkom je kryštalický konečný produkt, ktorý sa potom použije na prípravu injekčných roztokov používaných pri liečbe ťažkého diabetes mellitus typu I a II. Hlavný účinok tohto hormónu v tele sa prejavuje poklesom hladiny glukózy obsiahnutej v krvi.

Fázy výroby inzulínu budú nasledovné:

Predbežný. Vykonáva také operácie ako je príprava a čistenie vody a vzduchu, čistenie priemyselných priestorov a sterilizácia zariadení, kontrola personálu, spracovanie rúk a vydávanie sterilných obuvi a odevov. Aj v predbežnom štádiu sa uskutočňuje primárna chemická syntéza molekulových reťazcov, z ktorých sa zostavuje proteín. Reťazec A obsahuje 21 aminokyselinových zvyškov a reťazec B obsahuje 30 aminokyselín.
Príprava živinových roztokov a bunkovej kultúry. Aby sa živá bunka vytvorila potrebná zlúčenina, zaviedol sa príslušný gén. Za týmto účelom sa plazmid rozštiepi špeciálnymi enzýmami, restriktázami a génmi kódujúcimi syntézu potrebných zlúčenín sa do neho šité. Potom sa pomocou mikroinjekčnej metódy modifikovaný plazmid vráti do bunky.
Kultivácia bunkovej suspenzie. Geneticky modifikované bunky sa umiestnia do živného roztoku, ktorý má všetky zložky potrebné na rast a reprodukciu a podstupuje sterilizáciu. Kultivácia kultúry sa uskutočňuje v špeciálnych bioreaktoroch, kde sa kŕmil predčistený vzduch. Pravidelne sa do reaktora pridá určité množstvo živného roztoku a súčasne sa odoberá rovnaký objem bunkovej suspenzie.
Prideľovanie kultúry. Oddelenie kvapaliny a bunkovej kultúry sa vykonáva sedimentáciou (sedimentáciou) v špeciálnych usadzovačoch a potom filtráciou, čo umožňuje zachovať celistvosť buniek.
Chromatografické čistenie látky. Vykonáva sa na vhodnom zariadení s použitím rôznych metód, najmä čelnej, aniónovej výmeny a gélovej permeačnej chromatografie.
Získanie proteínovej molekuly. V skutočnom biotechnologickom štádiu dochádza k syntéze neprípustnej molekuly inzulínu. A dve zložky reťazí. Šité po oxidácii a skladaní získaných reťazcov, čo vedie k vzniku disulfidových mostíkov.
Sušenie vymrazovaním v špeciálnej peci, po ktorej sa výsledný kryštalický prípravok skontroloval na dodržanie štandardu, zabalil, označil a dodal spotrebiteľovi.

Naša spoločnosť za výhodných podmienok ponúka hotové výrobné linky, v ktorých sa plne dodržiava technológia výroby inzulínu. Vďaka presným výpočtom, technickej a informačnej podpore, ako aj personálnemu školeniu v rámci komplexného programu bude spoločnosť zisková a jej produkty budú požadované.

Inzulínový objav

Dnes má cukrovka na planéte viac ako 400 miliónov ľudí, čo je asi 8% dospelého obyvateľstva na svete. Podľa štátneho registra viac ako 3,3 milióna ľudí trpí cukrovkou v Rusku (približne 300 000 ľudí trpí cukrovkou typu 1 a približne 3 milióny ľudí trpia cukrovkou typu 2). Je však nepravdepodobné, aby tieto údaje odrážali skutočnú situáciu. Všetci títo ľudia, žijúci každý deň, chápu, že ich život závisí od inzulínu.

Prvé pokusy vyliečiť diabetes boli vykonané pred našou éru. Pre túto masáž, gymnastiku, kúpele, aromaterapiu a oveľa viac používali starí grécki a rímsky lekári. V 19. storočí bola pre diabetikov vyvinutá strava s nízkym obsahom sacharidov. Prvý pokus o liečbu cukrovky s inzulínovými injekciami bol uskutočnený v roku 1921. Kanadský vedec Frederick Banting sa stal prvým človekom, ktorý používal hormón inzulínu na kontrolu diabetu. Keď získal Nobelovu cenu v medicíne, mal len 32 kódov. Liek účinne vytvoril a bez vedľajších účinkov znížil hladinu glukózy z 28,9 na 6,7 mmol / l. Táto droga dala mnohým nádej na život.

V roku 1869 objavil vedec Paul Langergans skupiny buniek v pankrease, ktoré neskôr pomenovali po ňom "ostrovy Langerhans". Inzulín bol následne izolovaný z buniek týchto ostrovčekov. Inzulín je hormón, ktorý reguluje metabolizmus, hlavne uhľohydrátov (cukrov), ale aj tukov a bielkovín. Pri cukrovke v dôsledku nedostatočnej expozície inzulínu sa objavuje komplexná metabolická porucha, zvyšuje sa hladina krvného cukru (hyperglykémia), cukrov sa vylučuje močom (glykozúria) a kyslé produkty zhoršeného spaľovania tukov sa objavujú v krvoketone (ketoacidóza).

Po objavení inzulínu začali mnohí vedci rozvíjať metódy čistenia tejto drogy, pretože sú to nečistoty, ktoré majú škodlivý účinok na oslabené telo.

Spoločnosť Agilent Technologies je globálnym lídrom v analytickom zariadení. Zariadenia na chromatografickú a spektrálnu analýzu dlhšie ako jeden rok pomohli vedcom na celom svete riešiť zásadné problémy liečiv. Kontrola čistoty inzulínu nie je výnimkou. Predtým sa na tieto účely použila klasická kvapalinová chromatografia, pričom sa dosiahli dosť prijateľné výsledky:

Po mnohých výskumoch vedci dokázali, že vytvorený inzulínový polypeptid s molekulovou hmotnosťou asi 6000 sa účinne identifikuje použitím najnovšieho vývoja v oblasti vylučovacej chromatografie.

Pomocou tejto novej metódy je možné porovnať "dobrý inzulín", ktorý bol uložený v odporúčaných podmienkach a "zlý inzulín". Keď sa dva chromatogramy navzájom prekrývajú, ukázalo sa, že v inzulínovom prípravku, ktorý bol uskladnený za nepriaznivých podmienok, bola cieľová molekula zničená a miesto toho boli na chromatograme identifikované rozkladné produkty.

Vývoj a zjednotenie metód na analýzu a štandardizáciu inzulínových prípravkov pomocou vysokotlakej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou (RP HPLC) Pikhtar Anatoly Vasilievich

Táto dizertačná práca by mala ísť do knižnice v blízkej budúcnosti.
Informujte o prijatí

Práca - 480 rubľov, doručenie 10 minút, nepretržite, sedem dní v týždni a sviatky.

Abstrakt - 240 rubľov, doručenie 1-3 hodiny, od 10-19 (moskovský čas), okrem nedele

Pihtar Anatoly Vasilyevich. Vývoj a zjednotenie metód analýzy a štandardizácie inzulínových preparátov pomocou vysokotlakej kvapalinovej chromatografie s reverznou fázou (RP HPLC): disertačná práca. Kandidát farmaceutických vied: 15.00.02 / Pihtar Anatoly Vasilievich; [Miesto ochrany: moskovská lekárska akadémia].- Moskva, 2005.- 139 s.: Il.

Obsah pre dizertačnú prácu

KAPITOLA 1. Preskúmanie literatúry 11

1. Úloha inzulínu pri liečbe diabetes mellitus 11

2. Biosyntéza a biologický účinok inzulínu 12

3. Všeobecné charakteristiky fyzikálno-chemických a farmaceutických vlastností inzulínu 15

4. Inzulínové prípravky 24

5. Metódy výroby, štandardizácia a kontrola kvality inzulínových prípravkov 31

6. Použitie HPLC pri farmaceutickej analýze inzulínu. 46

KAPITOLA 2. Vyhlásenie o probléme 50

KAPITOLA 3. Štúdia vplyvu rôznych faktorov na chromatografické správanie inzulínu v podmienkach RP HPLC 56

1. Metódy a materiály 57

2. Diskusia o výsledkoch 62

2.1. Vplyv zloženia tlmivého roztoku 62

2.2. Účinok koncentrácie síranu sodného 68

2.3. Vplyv teploty chromatografickej kolóny 70

2.4. Účinok organického modifikátora 75

2.5. Vplyv dĺžky alkylových radikálov naočkovanej fázy 80

2.6. Vplyv dĺžky chromatografickej kolóny 80

KAPITOLA 4. Zlepšenie farmakologických metód na analýzu inzulínových prípravkov založených na použití RP HPLC 82

1. Výber optimálnych podmienok pre chromatografické stanovenie inzulínu a jeho nečistôt v liečivých prípravkoch 82

Metrologické charakteristiky metódy 84

3. Použitie vyvinutej metodiky na testovanie úradných inzulínových prípravkov 95

KAPITOLA 5. Vývoj metód na analýzu injekčných dávkových foriem izofán-inzulínu založených na metóde PF HPLC 107

1. Voľba podmienok pre chromatografické stanovenie protamínu v dávkových formách izofánu-inzulínu 110

2. Štúdia chromatografických profilov protamínov izolovaných z rôznych druhov rýb 121

3. Metóda stanovenia protamínu v izofánno-inzulínových prípravkoch 123

4. Validácia vyvinutej metodiky 125

Všeobecné závery 136

Odkazy 139

Všeobecné charakteristiky fyzikálno-chemických a farmaceutických vlastností inzulínu

Z chemického hľadiska je inzulín malý globulárny proteín s molekulovou hmotnosťou do 6000 Da. Zároveň treba poznamenať, že inzulín je bežný názov pre celú rodinu homológnych proteínov prírodného a umelého pôvodu so spoločnou charakteristickou biologickou aktivitou. Proteínová povaha inzulínu bola stanovená v roku 1928 [52]. Jedná sa o proteíny, ktoré produkujú biuretovú reakciu a Pauliho reakciu. Štruktúra inzulínu bola úplne založená na začiatku 50. rokov. Základné chemické zloženie inzulínov rôzneho pôvodu sa vyznačuje údajmi uvedenými v tabuľke 1 [40].

Zloženie aminokyselín. Väčšina molekúl inzulínu obsahuje 51 aminokyselinových zvyškov, medzi ktorými je 17 aminokyselín vo väčšine známych proteínov.

Charakteristickým znakom aminokyselinového zloženia bovinného, prasačieho a ľudského inzulínu je tryptofán a metionín. Zloženie aminokyselín týchto typov inzulínu je uvedené v tabuľke 2 [40,46].

Inhibítor všetkých druhov inzulínu je obsah cystínu (6 polo-cystínových zvyškov). Navyše inzulínová molekula všetkých typov obsahuje 6 amidových skupín (asparagín, glutamín).

Keď sa inzulín uvoľní spolu s hlavnou frakciou, môžu sa pozorovať frakcie deamidovaných foriem inzulínu. V kyslom prostredí sa v procese deamidácie postupne odštiepi všetkých šesť amidových skupín a elektroforetická a chromatografická mobilita inzulínu sa mení [40]. Tvorba deamidovaných foriem inzulínu môže byť posúdená výsledkami stanovenia amoniaku. Pre plne amidovú formu inzulínu sa stanoví 6 mol amoniaku na 1 mol proteínu, pre deamidované formy môže byť táto hodnota 5 až 0.

Primárna štruktúra inzulínu. Primárnu štruktúru inzulínu rozlúčila skupina Sanger v rokoch 1945-1955. Cez sériu chromatografických metód, ktoré sa nechajú oddeliť a identifikovať jednotlivé peptidy, aminokyseliny a ich deriváty, Sanger schopný stanoviť primárnu štruktúru hovädzieho inzulínu [130,131,132,133,134,135]. Ďalšie štúdie inzulín rôzneho pôvodu s použitím rôznych fyzikálno-chemickými metódami, vrátane spôsobu Edman na stanovenie celú aminokyselinovú sekvenciu dlhých peptidov potvrdila zistenia Senger et al inzulínovej štruktúry [bb].

Doteraz bola primárna štruktúra inzulínu určená zástupcami 24 druhov patriacich do 4 tried zvierat: cicavcov, vtákov, rýb a cyklostómov [14]. Výskum inzulínu rôzneho pôvodu pokračuje [71,72,73].

Štruktúra inzulínu u rôznych zvierat je podobná, ale nie identická. Vo svojej primárnej štruktúre je ľudský inzulín podobný ako ošípaná, pes, spermie a králičie inzulíny, ktoré sa líšia len v jednej aminokyseline [40]. Odlišuje sa od hovädzieho inzulínu tromi aminokyselinami. Vo väčšom rozsahu ľudský inzulín nie je podobný inzulínu guinejského ošípanej, vtákov a rýb [40]. Rozdiely v aminokyselinovej sekvencii ľudských, ošípaných a hovädzích inzulínov sú uvedené v tabuľke 3.

Napriek štrukturálnym rozdielom majú všetky typy inzulínov podobnú biologickú aktivitu, t.j. hypoglykemický účinok. Avšak hodnota vykazovala biologickú účinnosť silne závisí od druhu rastlín, a je v rozmedzí od 11 IU / mg (v Severnom mori inzulínu COD) a 62 IU / mg (inzulín morčacie a kuracie), v ktorom je činnosť ľudského inzulínu je v poriadku 25-30 IU / mg [40]. Čím sú medzidruhové rozdiely väčšie, tým väčší je rozdiel v biologickej aktivite zodpovedajúceho inzulínu.

Funkčne aktívna molekula inzulínu pozostáva z dvoch polypeptidových reťazcov (reťazcov A a B) spojených disulfidovými väzbami; jeden spoj je tvorený siedmy aminokyselinové zvyšky z dvoch reťazcov, druhý disulfidovou väzba je tvorená 20. zvyšku A-reťazca a 19. zvyšok B-reťazca (obrázok 2). Okrem toho, inzulínová molekula má tretiu disulfidovou väzbu, ktorá spája vnitrořetězcový a 6. a 11. zvyšky v reťazci [59.117].

Sekundárna štruktúra Použitie odlišné fyzikálno-chemické a fyzikálne metódy, bolo preukázané, že inzulínová molekula je charakteristické veľmi trojrozmerné štruktúry (konformácie), čo prispieva ku špecifické biologické funkcie [14]. V molekule natívneho inzulínu sú prítomné súčasne aj kryce skrutkovice a p-záhyb. Okrem toho existujú oblasti s neusporiadanou štruktúrou a štruktúrou <3-петли. Участки, имеющие форму а-спирали, составляют 57 %, 6 % приходится на [3-складчатую структуру, 10 % построено в виде р-петли, оставшиеся 27 % не имеют упорядоченной структуры (рисунок 3) [25].

Pri zahriatí sa kyslý roztok inzulínu (pH 3.2.a-5.02.) Pri teplote 100 ° C a rýchle ochladenie na -80 ° C, tzv fibrilárna inzulínu - hormónu úplne inaktívne formy [27]. Pridanie inzulínu fibrilárna vlákien do aktívneho roztoku inzulínu spôsobuje spontánny kvantitatívne vyzrážanie inzulínu vo forme fibríl [14,17].

Výrobné metódy, štandardizácia a kontrola kvality inzulínových prípravkov

Získanie druhov zvieracieho inzulínu. Priemyselná výroba hovädzieho a bravčového inzulínu bola zavedená takmer súčasne v niekoľkých krajinách, čoskoro po objavení inzulínu v roku 1921 [63]. Odvtedy zostáva koncept získania inzulínu prakticky nezmenený (tabuľka b) [17, 18]. Surovinami na výrobu živočíšnych druhov inzulínu sú pankreas z jatočného hovädzieho dobytka používaného v potravinách.

Najdôležitejšou úlohou pri výrobe inzulínu je jej čistenie - uvoľnenie látok z sprievodných nečistôt, ktoré znižujú biologickú aktivitu, čo spôsobuje imunologickú reakciu alebo potenciálne nebezpečné pre zdravie pacienta. Napríklad po niekoľkých rokoch používania zle purifikovaného inzulínu v krvi pacienta môže byť až 5 000 IU inzulínu viazaných na protilátky. Protilátky proti inzulínu významne ovplyvňujú profil jeho účinku a tým prispievajú k nestabilnému priebehu diabetu.

Prvým spôsobom čistenia inzulínu bola rekryštalizácia v prítomnosti zinočnatých solí. V roku 1945 sa ukázalo, že inzulín sedemnásobný rekryštalizácia značne znižuje alergické reakcie u pacientov, v porovnaní s úradníkom v čase inzulínových prípravkov [63].

protiprúdové extrakcie (PE), rozdeľovaču chromatografia (PX), iónovo-výmennou chromatografiou (MOV) diskelek-troforeza (DEF), a vylúčenie chromatografie na silikagélu (GEH) [63] za použitia počtu vzoriek metódy heterogenity inzulínu po kryštalizácii a jediný kryštalizácie ukazuje,

Bolo zistené, že hlavné nečistoty sú súčasne inzulín: proinzulínu, ich medziproduktov, kovalentné dimér inzulínu, monodezamidoinsulin a monoarginin monoetilinsulin, rovnako ako množstvo vysokomolekulárnych zlúčenín nie sú prirodzené inzulín. Generalizované závery štúdií, pričom do úvahy informácie o imunologické aktivity detekované nečistoty [138], záver bol potreba ďalšieho čistenia inzulínu látok, tak, že analytické metódy a DEF GEH detekovaný jednu zložku - zodpovedajúce inzulín.

Pre vyriešenie problémov v čistení inzulínu GEH 1950 spôsobe bolo navrhnuté, a v roku 1970 spôsob anionoobmennoi chromatografie (AOX). Zistilo sa, že inzulín, čistený metódou AOX, obsahuje asi 500 ppm (častí na milión) nečistôt s proinzulínovou aktivitou [137]. Ďalšie čistenie inzulínu za použitia vysokotlakovej kvapalinovej chromatografie na reverznej fáze (RP HPLC) na zníženie obsahu imuno-génu frakcií pred detekčný limit [63].

Prehľad aktuálneho vývoja v oblasti chromatografického čistenia inzulínu je uvedený v [96]. Inzulín, purifikovaný postupne s použitím IOC a GEC, sa nazýva monokomponentný inzulín [63]. Získanie ľudského inzulínu. Hľadanie metód na získanie ľudského inzulínu bolo spôsobené dvomi okolnosťami. Na jednej strane, relevantnosti surovín problém v prípade produkcie zvieracieho inzulínu, na druhej strane - rýchly rozvoj vedy v tejto oblasti skutočnú príležitosť dať myšlienku do praxe. V rokoch 1979 a 1981 takmer súčasne boli vyvinuté dva spôsoby získania ľudského inzulínu - biosyntetické a polosyntetické [102, 108]. V roku 1981 sa spoločnosť Novo Nordisk po prvýkrát na svete začala sériovo vyrábať ľudský polo-syntetický inzulín. Spôsob používaný spoločnosťou je založený na enzymatickom a chemickom nahradení Al v molekule prasačeného inzulínu so zvyškom Tre [61]. Táto metóda je priamo závislá od získania požadovaného množstva prasačieho inzulínu, čo znižuje jeho ekonomickú hodnotu. Možnosť získavania ľudského inzulínu pomocou biosyntetickej metódy sa objavila pri vývoji technológie rekombinantnej DNA [10]. Práce na geneticky upravenej inzulínovej výrobe sa začali pred približne 25 rokmi. V roku 1978 bolo zistené, že bol získaný kmeň E. coli produkujúci potkanie proinsuling. V roku 1979 boli Genentechove štúdie schopné klonovať do E. coli gény kódujúce aminokyselinové sekvencie. inzulínových reťazcov A a B zahrnutých v p-halogén-tikidázovej oblasti plazmidu pBR322 [10,102]. V roku 1981 sa syntetizuje proinzulinový gén analog - mini-proinzulínu-C, kde sa 35-ulcerózna segmentu C-peptid nahradený šiestich aminokyselín: Arg-Arg-Gly-Ser-Lys-Arg a ukazuje jeho expresiu v E. coli. V roku 1982 spoločnosť Eli Lilly začala s prvou priemyselnou produkciou ľudského inzulínu na svete pomocou technológie dvoch reťazcov vyvinutého v spolupráci s Genentechom [102]. V súčasnosti sa preukázala možnosť získavania ľudského inzulínu pomocou rôznych expresných systémov [3,10,101,102]. Z hospodárskeho hľadiska je použitie geneticky modifikovaných kmeňov gram-pozitívnych baktérií E.coli, z ktorých mnohé sú považované za nadproduktory, zvlášť zaujímavé [3]. Zároveň sa dosiahol významný pokrok pri bunkách kvasiniek Saccharomices cerevisiae [3,75]. Tabuľka 7 uvádza hlavné, spoločné pre rôzne metódy produkcie rekombinantného ľudského inzulínu, etapy technologického procesu [3,10,63].

Aplikácia vyvinutej metodiky na testovanie oficiálnych inzulínových prípravkov

Vysokotlaková kvapalinová chromatografia (HPLC) - varianta stĺpci kvapalinová chromatografia, pričom mobilná fáza - eluent - plniace stĺpec prejde sorbentu pri vysokej rýchlosti v dôsledku značného tlaku (až 400h105 Pa) na vstupe do kolóny [11].

Ako spôsob analýzy komplexných zmesí látok sa HPLC ukázala pred viac ako 30 rokmi. Použitie sorbentov s priemerom častíc 3 až 10 μm spôsobilo prudké zvýšenie účinnosti chromatografickej separácie v porovnaní s klasickou verziou kolónovej kvapalinovej chromatografie. HPLC sa preto často označuje ako vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC). Inštrumentálne vlastnosti použitia HPLC sú podrobne opísané v mnohých príručkách [49.50] av príslušných častiach vedúceho liekopisu [79, 150]. Pre HPLC sa vyvinula a vyrába široká škála sorbentov. Podľa autorov prieskumu [51] približne 100 firiem na celom svete vyrába viac ako 300 druhov sorbentových názvov. História, súčasný stav a perspektívy vývoja metódy sú diskutované v prehľadoch [51] a [77.78].

V rôznych variantoch sa metóda HPLC široko používa vo farmaceutickej analýze (kontrola výroby a testovanie kvality lieku). Metóda je zahrnutá vo všetkých vedúcich liekopisoch sveta. Táto metóda je úplne opísaná v európskych a amerických liekopisoch. Na identifikáciu liekov sa používa HPLC, na určenie čistoty, frakčného zloženia molekulovej hmotnosti a kvantitatívnej analýzy. V US Pharmacopoeia 28 ed. približne 30% súkromných článkov zahŕňa použitie HPLC. V Európskom liekopise 4. vyd. toto číslo je asi 40%.

Prvou chromatografickou metódou na testovanie inzulínu bola nízkotlaková kvapalinová chromatografia (GE ZhND). Princíp separácie za podmienok HPLC je založený na rôznej schopnosti molekúl rôznych veľkostí preniknúť do pórov neutrálneho gélu, ktorý slúži ako stacionárna fáza. Hydrodynamický priemer inzulínového monoméru a diméru je úmerný ich molekulovej hmotnosti a je 2,69 a 5,50 nm [115].

V roku 1967 sa pomocou metódy GE-IHDD ukázalo, že komerčné prípravky inzulínu, čistené kryštalizáciou, obsahujú nečistoty s molekulovou hmotnosťou presahujúcou molekulovú hmotnosť inzulínu [63]. Na chromatogramech prasačieho inzulínu sa našli tri píky, bežne označované ako a-, b- a c-zložky. Odvtedy bolo navrhnuté množstvo chromatografických systémov na kontrolu obsahu nečistôt s vysokou molekulovou hmotnosťou v inzulínových prípravkoch. Separácia sa uskutočňovala na vysoko napučiavajúcich agarózových xerogéloch (Bio-Gel P-30, Bio-Rad Lab.) Alebo dextrán (Sephadex G-50, Pharmacia Fine Chemicals). Ako IF [127] sa použili 1-3 M roztoky kyseliny octovej. Vysoká citlivosť týchto sorbentov na stláčanie pri tlakoch presahujúcich tlak napučiavania matrice spôsobuje, že tieto materiály sú nevhodné pre prevádzku v režime HPLC.

Použitie kvapalinovej chromatografie s vylúčením gélu pri vysokých tlakoch (GE HPLC) na analýzu inzulínu bolo najskôr opísané v roku 1980 po vývoji tvrdých makroporéznych sorbentov kompatibilných s vodou a odolávajúcich vysokým tlakom. V [151] Separácia sa uskutoční na stĺpci Protein-Pak 1-125 (Waters), TSK-gél SW 2000 (Toho Soda Corp.), Bondagel (Pharmacia) za denaturačných podmienok (7 M močoviny zmesi roztoku minerálnych kyselín alebo iónu detergenty). Potreba analýzy inzulínu pri denaturačných podmienkach je spojená so schopnosťou inzulínu agregovať v roztoku. Na oddelenie inzulínu v podmienkach vysokotlakej kvapalinovej chromatografie HPLC sa tiež opísalo použitie "tradičného" elučného činidla kyseliny octovej [152]. Použitie kyseliny octovej má niekoľko výhod - minimálny vplyv na natívnu štruktúru oddelených zlúčenín, dostupnosť, nízke náklady, navyše dôležitou skutočnosťou je schopnosť kyseliny octovej potlačiť spojenie inzulínu.

V súčasnosti je HPLC ghvd liekopisnou metódou na sledovanie obsahu nečistôt s vysokou molekulovou hmotnosťou v látkach a hotových dávkových formách. Tento spôsob sa tiež používa na stanovenie obsahu protamínu v izofánno-inzulínových prípravkoch.

Použitie HPLC na obrátených fázach (RP HPLC) na separáciu hovädzieho dobytka a prasačieho inzulínu prvý raz preukázalo vysokú účinnosť tejto metódy na analýzu inzulín podobných peptidov s podobnou štruktúrou.

Mechanizmus separácie proteínov a polypeptidov za podmienok RP HPLC je založený na rozdielnej hydrofóbnosti molekúl inzulínu a príbuzných nečistôt. K dnešnému dňu bolo opísaných niekoľko desiatok spôsobov chromatografickej separácie inzulínu rôzneho pôvodu a ich derivátov, vrátane proin-sulínu, pankreatických polypeptidov, dezamidových derivátov, diméru inzulínu. [126] ukázala možnosť oddelenia kurčiat, králikov, oviec a inzulínu koní. Ľudský, hovädzí a bravčový inzulín bol tiež oddelený. Lloyd a Corran publikovali metódu oddelenia hovädzieho, bravčového, ľudského inzulínu a zodpovedajúcich deamidovaných foriem [104].

Separácia sa uskutočňuje na modifikovaných sorbentoch silikagélu, metylových, butylových, oktylových, oktadecylových a fenylových skupinách v izokratickom alebo gradientovom móde. Ako PF sa používajú organické modifikátory - acetonitril, metylalkohol, izopropylalkohol, zmiešané s vodnými tlmivými roztokmi obsahujúcimi anorganické soli a činidlá proti iónovému paru. Peaková detekcia sa uskutočňuje hlavne spektrofotometrickou metódou pri vlnovej dĺžke 190-220 nm, sú tiež opísané fluorimetrické metódy [103].

Analýza látky a hotových dávkových foriem inzulínu pomocou RP HPLC je opísaná v súkromných článkoch v Americkom a Európskom liekopise [79, 150]. Metóda sa používa na testovanie liekov špecifikovanej skupiny z hľadiska "autenticity inzulínu", "príbuzných bielkovín", "kvantitatívnej determinácie" a "inzulínu v roztoku".

Výskumná literatúra tiež opisuje použitie iónovo-výmennej a afinitnej chromatografie na inzulínovú analýzu [44, 102], avšak tieto metódy neboli široko používané v liekopise.

Výber podmienok pre chromatografické stanovenie protamínu v dávkovacích formách izofánu-inzulínu

Zvýšené ion PF sily zvyčajne vedie k zvýšeniu súčiniteľa inzulínu kapacity, ktorá môže byť spôsobené viacerými faktormi: - koncentrácia zvýšenie iónov znižuje stupeň ionizácie nabitých skupín molekuly proteínu, čím sa zvyšuje jej hydrofóbnosti / - vysoká koncentrácia katiónu prispieva ku tienenie voľných silanolových skupín na povrchu stacionárne fáza, ktorá oslabuje nešpecifickú elektrostatickú interakciu protonovaných aminoskupín proteínu s matricou; - vysoká iónová sila ovplyvňuje priestorovú štruktúru inzulínu, v dôsledku čoho sa mení povrch dostupný interakcii so sorbentom. Koncentrácia anorganických solí v FS ovplyvňuje tvar vrcholov a selektivitu separácie inzulínu a desamido-Asn-inzulínu [143, 144]. Pri isokratická elúcie na sorbentu LiChrosorb Sіv 0,1 M roztoku fosforečnanu sodného (pH 2,3), uspokojivého výsledku bolo dosiahnuté iba pridanie síranu sodného do roztoku pufru na koncentráciu 0,1 M. Väčšina techník analýzy inzulín súčasťou liekopisnej monografií a ND, použite PF na báze tlmivých roztokov s obsahom síranu sodného rovným 0,2 M. Takýto vysoký obsah síranu sodného negatívne ovplyvňuje reprodukovateľnosť výsledkov chromatografie v dôsledku stratifikácie elučných činidiel, vysoko koncentrované soľné roztoky majú negatívny vplyv na chromatografické zariadenia, čo skracuje ich životnosť. Vzhľadom na to, že liekopisné metódy analýzy boli vyvinuté pred viac ako dvadsiatimi rokmi, bolo zaujímavé študovať chromatografické správanie inzulínu pod OF-HPLC na chromatografických sorbentoch poslednej generácie v závislosti od koncentrácie síranu sodného. Súčasne sa pokúsili zistiť, či je prípustné zníženie obsahu síranu sodného v PF bez výrazného zhoršenia separačnej schopnosti chromatografického systému. V dôsledku výskumu sa zistilo, že účinok koncentrácie síranu sodného v PF je odlišný v závislosti od druhu očkovanej fázy, ako aj od druhu inzulínu. Na sorbentoch s očkovanými skupinami C4 a C selektivita oddelenia vrcholov ľudského inzulínu a desamido-Asn-ľudského inzulínu nezávisí od koncentrácie síranu sodného. roztoku pufra v rozmedzí od 0,05 M do 0,2 M. Na sorpente Diaspher-110-C18 má separačná selektivita tohto páru píkov maximálne 0,05 M a minimálne 0,1 M (graf 4). Na druhej strane selektivita separácie živočíšnych druhov inzulínu a ich zodpovedajúcich desamidovaných foriem AsnA21 nezávisí od iónovej sily roztoku, keď sa oddelí na sorbente Diaspher-110-C18. Na sorbente s roubovanými skupinami C8 sa selektivita zvyšuje z 1,25 na 1,28 s nárastom koncentrácie síranu sodného (obrázok 4). Na sorbentu vrúbľované skupiny C4 selektivity separácie v prípade hovädzieho inzulínu maximálna, keď bola zistená 0,1 M síranu sodného a minimálne na 0,2 M. Za bravčového inzulínu výrazné maximum pri koncentrácii síranu sodného 0,1 M, v tomto prípade zvýšenia iónovej sily viedli k zníženiu selektivity separácie (obrázok 4). Počet účinných teoretických platní sa zvyšuje so zvyšujúcou sa koncentráciou síranu sodného. Výnimkou je správanie ľudského inzulínu na sorbente Diasfer-110-C8 (obrázok 5). Stupeň oddelenia špičiek inzulínu a desamido-Asn-inzulínu sa zvyšuje so zvýšením iónovej sily FS, bez ohľadu na druh inzulínu a typ štepenej fázy (schéma b). Znížením koncentrácie síranu sodného z 0,2 M na 0,1 M sa stupeň oddelenia vybraného páru pikov v priemere znižuje o 5% pre ľudské a prasacie inzulíny a o 10% pre hovädzí inzulín. Vzhľadom na skutočnosť, že absolútna hodnota stupňa separácie presahuje 2,0, merané zhoršenie separačnej kapacity stĺpca podľa nášho názoru nie je významné. V dôsledku toho sa môže koncentrácia síranu sodného v tlmivom roztoku PF znížiť dvakrát v porovnaní s liekopisnými analytickými metódami.

Vo väčšine štúdií na analýzu proteínov a peptidov sa separácia uskutočňuje pri izbovej teplote. Okrem toho niektorí autori naznačujú, že vplyv teploty na selektivitu pri separácii je minimálny [48]. Avšak s rastúcou teplotou sa zrýchľuje proces hromadnej výmeny medzi stacionárnou a mobilnou fázou, čo vedie k zníženiu retenčného času peptidov a zúženiu píkov.

Inzulínová technológia

Porušenie sekrécie inzulínu. Použitie pridruženej fotografie. Schéma inzulínu. Expresia proinzulínu v bunkách E. coli. Prístupy k riešeniu problému cukrovky. Príspevok biotechnológie k priemyselnej výrobe nepeptidových hormónov.

Pošlite svoju dobrú prácu do vedomostnej základne je jednoduché. Použite nižšie uvedený formulár.

Študenti, študenti absolventov, mladí vedci, ktorí používajú vedomostnú základňu pri štúdiu a práci, vám budú veľmi vďační.

Publikované dňa http://www.allbest.ru/

MINISTERSTVO VZDELÁVANIA A VEDY KAZACHSTANKEJ REPUBLIKY

KAZAKH AGRO-TECHNICKÁ UNIVERZITA NÁZOV PO S.SEYFULLIN

Oddelenie mikrobiológie a biotechnológie

Na disciplíne "Biotechnológia mokroorganizmov"

Na tému: technológia pre inzulín

Dokončené: Myrzabek M? Lir Kurbanbek? Yzy

Začiarknuté: Akimbaeva A.K. (k.B.N.)

SKRATKY A SYMBOLY

1. História objavu

2. Získanie inzulínu v biotechnológii

3. Spôsoby získavania ľudského inzulínu

4. Expresia proinzulínu v bunkách E. coli

5. Čistenie inzulínu

6. Dávkovanie a podávanie

V tomto kurze boli použité nasledovné definície:

Proteínový nosič - zabezpečujúci transport hybridného proteínu v periplazmatickom priestore bunky alebo kultivačného média;

Afinitná zložka - výrazne uľahčuje výber hybridného proteínu.

Inzulín (z latinskej insulácie - ostrov) - peptidový hormón sa vytvára v beta bunkách ostrovčekov Langerhans pankreasu.

Interleukíny sú skupina cytokínov syntetizovaných hlavne leukocytmi (z tohto dôvodu bol zvolený koncový "-leukín").

Proinzulín je prekurzorom inzulínu syntetizovaného B bunkami ostrovného aparátu pankreasu.

Chromatografia (z gréčtiny, chroma, farbivo - farba, farba), fyzikálno-chemická metóda separácie a analýzy zmesí, založená na rozdelení ich zložiek medzi dve fázy - stacionárne a pohyblivé (eluent), pretekajúce stacionárne.

Zapuzdrenie - mechanizmus programovacieho jazyka, ktorý obmedzuje prístup k komponentom, ktoré tvoria objekt (metódy a vlastnosti), robí ich súkromím, to znamená, že sú prístupné iba v rámci objektu.

Fúzny proteín (fúzny proteín, tiež chimérny zlúčeninový proteín) je proteín získaný kombináciou dvoch alebo viacerých génov, ktoré pôvodne kódovali oddelené proteíny.

Hormóny (z gréckeho hormónu Hormao - uviesť do pohybu, indukovať), hormóny, biologicky aktívne látky produkované endokrinnými žľazami alebo endokrinnými žľazami a vylučované priamo do krvi.

Diabetes mellitus je skupina endokrinných ochorení, ktoré vznikajú v dôsledku absolútnej alebo relatívnej nedostatočnosti hormónu inzulínu.

Somatostatín je hormón delta buniek pankreatických ostrovčekov Langerhans, rovnako ako jeden z hormónov hypotalamu.

Rádioimunitná analýza je metóda kvantitatívneho stanovenia biologicky aktívnych látok (hormónov, enzýmov, liečiv atď.) V biologických tekutinách na základe konkurenčnej väzby požadovaných stabilných a podobných rádioaktúl-označených látok so špecifickými väzbovými systémami.

SKRATKY A SYMBOLY

HPLC - vysokoúčinná kvapalinová chromatografia

cDNA - komplementárna deoxyribonukleová kyselina

Hlavnou funkciou inzulínu je zabezpečenie priepustnosti bunkových membrán pre molekuly glukózy. V zjednodušenej forme možno povedať, že nielen sacharidy, ale aj akékoľvek živiny sú nakoniec rozdelené na glukózu, ktorá sa používa na syntézu iných molekúl obsahujúcich uhlík a je jediným typom paliva pre bunkové elektrárne - mitochondriá. Bez inzulínu permeabilita bunkovej membrány na glukózu klesá 20-násobne a bunky umierajú z hladovania a prebytočný cukor rozpustený v krvi jedmi telo.

Zhoršenie sekrécie inzulínu spôsobené deštrukciou beta buniek - absolútny nedostatok inzulínu - je kľúčovým prvkom v patogenéze diabetes mellitus 1. typu. Porušenie účinku inzulínu na tkanivo - relatívny nedostatok inzulínu - má dôležité miesto vo vývoji diabetu 2. typu.

Použitie afinitnej chromatografie významne znížilo obsah kontaminujúcich proteínov v prípravku s vyššou molekulovou hmotnosťou ako inzulín. Takéto proteíny zahŕňajú proinzulín a čiastočne štiepené proinzulíny, ktoré sú schopné indukovať produkciu antiinzulínových protilátok.

Použitie ľudského inzulínu od samého začiatku liečby minimalizuje výskyt alergických reakcií. Ľudský inzulín sa absorbuje rýchlejšie a bez ohľadu na formu liečiva má kratšie trvanie účinku ako zvierací inzulín. Ľudské inzulíny sú menej imunogénne ako bravčové, najmä zmiešané hovädzie a prasacie inzulíny.

Cieľom práce je študovať technológiu inzulínu. Na dosiahnutie týchto cieľov boli stanovené:

1. získanie inzulínu v biotechnológii

2. Spôsoby inzulínu

H. Purifikácia inzulínu

História objavenia inzulínu je spojená s menom ruského lekára I.M. Sobolev (druhá polovica 19. storočia), ktorý dokázal, že hladina cukru v ľudskej krvi je regulovaná špeciálnym hormónom pankreasu.

V roku 1922 bol prvýkrát zavedený inzulín izolovaný z pankreasu zvieraťa na desaťročného chlapca, diabetický pacient prekonal všetky očakávania a o rok neskôr americká spoločnosť Eli Lilly uvoľnila prvý zvierací inzulínový prípravok.

Po obdržaní prvej priemyselnej šarže inzulínu v najbližších niekoľkých rokoch bol pokrytý obrovský spôsob izolácie a čistenia. V dôsledku toho bol hormón dostupný pre pacientov s diabetom 1. typu.

V roku 1935 optimalizoval dánsky výskumník Hagedorn pôsobenie inzulínu v tele navrhnutím predĺženého lieku.

Prvé kryštály inzulínu boli získané v roku 1952 a v roku 1954 anglický biochemik G. Senger deciproval štruktúru inzulínu. Vývoj spôsobov čistenia hormónu od iných hormonálnych látok a produktov degradácie inzulínu umožnil získať homogénny inzulín nazývaný jednozložkový inzulín.

Na začiatku 70. rokov. Sovietskí vedci A. Yudaev a S. Shvachkin navrhli chemickú syntézu inzulínu, avšak realizácia tejto syntézy v priemyselnom meradle bola drahá a nerentabilná.

V budúcnosti dochádza k postupnému zlepšeniu stupňa čistenia inzulínov, čo znižuje problémy spôsobené alergiami na inzulín, zhoršenou funkciou obličiek, poškodením zraku a odolnosťou voči inzulínu. Na substitučnú terapiu bol potrebný najúčinnejší hormón u diabetes mellitus - homológny inzulín, to znamená ľudský inzulín.

V 80-tych rokoch umožnil vývoj molekulárnej biológie syntetizovať oba ľudské inzulínové reťazce s použitím E. coli, ktoré sa potom spojili do biologicky aktívnej molekuly hormónu a rekombinantný inzulín sa získal pomocou geneticky upravených kmeňov E. coli v Ústave bioorganickej chémie.

2. Získanie inzulínu v biotechnológii

Inzulín, peptidový hormón pankreatických ostrovčekov Langerhans, je hlavnou liečbou diabetes mellitus. Toto ochorenie je spôsobené nedostatkom inzulínu a prejavuje sa zvýšenou hladinou glukózy v krvi. Až donedávna bol získaný inzulín z pankreasu býka a prasaťa. Liečivo sa líšilo od substitúcií ľudského inzulínu s 1 až 3 aminokyselinami, takže hrozila alergická reakcia, najmä u detí. Veľké terapeutické použitie inzulínu bolo obmedzené jeho vysokými nákladmi a obmedzenými zdrojmi. Chemickou modifikáciou sa inzulín zo zvierat stal nerozlíšiteľný od človeka, ale to znamenalo dodatočné zvýšenie nákladov na výrobok. [1]

Od roku 1982 produkuje Eli Lilly geneticky upravený inzulín založený na samostatnej syntéze E. coli a B reťazcov. Náklady na výrobok výrazne klesli, produkovaný inzulín je identický s ľudským. Od roku 1980 sú v tlači správy o klonovaní proinzulínového génu, prekurzora hormónu, ktorý prechádza do zrelej formy s obmedzenou proteolýzou.

Technológia zapuzdrenia je tiež pripojená k liečbe cukrovky: pankreatické bunky v kapsule, zavedené raz do tela pacienta, produkujú inzulín do jedného roka.

Integrovaná genetika začala produkciu folikuly stimulujúcich a luteinizačných hormónov. Tieto peptidy sú zložené z dvoch podjednotiek. Na programe je otázka priemyselnej syntézy oligopeptidových hormónov v nervovom systéme, ankefínov, vytvorených z 5 aminokyselinových zvyškov a endorfínov, analógov morfínu. Pri racionálnom používaní týchto peptidov zmierňuje bolesť, vytvára dobrú náladu, zvyšuje účinnosť, sústreďuje pozornosť, zlepšuje pamäť, spája a bdenie. Príkladom úspešnej aplikácie metód genetického inžinierstva je syntéza β-endorfínu s použitím technológie hybridných proteínov opísanej vyššie pre ďalší peptidový hormón, somatostatín [2].

3. Spôsoby získavania ľudského inzulínu

Historicky je prvým spôsobom, ako získať inzulín na terapeutické účely, izolovať analógy tohto hormónu z prírodných zdrojov (pankreatické ostrovčeky hovädzieho dobytka a ošípaných). V dvadsiatych rokoch minulého storočia bolo zistené, že hovädzí a prasací inzulíny (ktoré sú v štruktúre a sekvencii aminokyselín najbližšie k ľudskému inzulínu) vykazujú aktivitu v ľudskom tele, ktorá je porovnateľná s ľudským inzulínom. Potom bol hovädzí alebo prasací inzulín dlhodobo používaný na liečbu pacientov s diabetom 1. typu. Po určitom čase sa však ukázalo, že v niektorých prípadoch sa protilátky proti hovädzím a prasacím inzulínom začnú hromadiť v ľudskom tele, čím sa znemožnia ich účinky.

Na druhej strane jednou z výhod tejto metódy získania inzulínu je dostupnosť surovín (ľahko sa získa veľký objem hovädzieho a bravčového inzulínu), ktorý zohral rozhodujúcu úlohu pri vývoji prvej metódy na získanie ľudského inzulínu. Táto metóda sa nazýva polosyntetická [3].

Pri tomto spôsobe výroby ľudského inzulínu sa ako surovina použil prasačí inzulín. Vyčistený inzulín z ošípaných bol štiepený C-koncovým oktapeptidom B-reťazca, po čom bol syntetizovaný C-koncový oktapeptid ľudského inzulínu. Potom bola chemicky pripojená, ochranné skupiny boli odstránené a získaný inzulín bol purifikovaný. Pri testovaní tejto metódy získania inzulínu bola dokázaná úplná identita hormónu získaného na ľudskom inzulíne. Hlavnou nevýhodou tejto metódy sú vysoké náklady na výsledný inzulín (aj teraz je chemická syntéza oktapeptidu drahá, najmä v priemyselnom meradle).

V súčasnosti sa ľudský inzulín získava hlavne dvoma spôsobmi: modifikáciou bravčového inzulínu metódou syntézy a enzymu a metódou genetického inžinierstva.

V prvom prípade je tento spôsob založený na skutočnosti, že prasačí inzulín sa líši od ľudského inzulínu jedinou substitúciou na C-konci B-reťazca Ala30Thr. Nahradenie alanínu treonínom sa uskutočňuje enzýmom katalyzovaným štiepením alanínu a namiesto toho sa viaže treonínový zvyšok chránený karboxylovou skupinou prítomný v reakčnej zmesi vo veľkom nadbytku. Po štiepení ochrannej O-terc-butylovej skupiny sa získa ľudský inzulín. (obrázok 1)

Obrázok 1 - Schéma spôsobov výroby ľudského inzulínu

Inzulín bol prvý proteín získaný na komerčné účely s použitím technológie rekombinantnej DNA. Existujú dva hlavné prístupy k získaniu geneticky upraveného ľudského inzulínu. V prvom prípade produkujú obidva reťazce oddelené (rôzne produkujúce kmene), po ktorých nasleduje zloženie molekuly (tvorba disulfidových mostíkov) a oddelenie misoformu. V druhom prípade prípravok vo forme prekurzora (proinzulín), po ktorom nasleduje enzymatické štiepenie trypsínom a karboxypeptidázou. Do aktívnej formy hormónu. Najvhodnejšou je v súčasnosti výroba inzulínu ako prekurzora, ktorá zabezpečuje správne uzatvorenie disulfidových mostíkov (v prípade oddelenej produkcie reťazcov, uskutočňujú sa po sebe nasledujúce cykly denaturácie, oddeľujú sa misoformy a renaturácie [3]).

V obidvoch prístupoch je možné získať ako východiskové zložky (A a B reťazce, alebo proinzulín) ako súčasť hybridných proteínov. Okrem A- a B-reťazca alebo proinzulínu môže byť prítomné aj v zložení hybridných proteínov:

1) nosičový proteín - zabezpečenie transportu hybridného proteínu do periplazmatického priestoru bunky alebo kultivačného média;

2) afinitná zložka - významne uľahčuje výber hybridného proteínu.

Súčasne môžu byť obidva tieto zložky súčasne prítomné v zložení hybridného proteínu. Navyše, pri vytváraní hybridných proteínov sa môže použiť princíp multidimenzionality (to znamená, že niekoľko kópií cieľového polypeptidu je prítomných v hybridnom proteíne), čo umožňuje významne zvýšiť výťažok cieľového produktu [4].

Použili sme kmeň JM 109 N1864 s nukleotidovou sekvenciou vloženou do plazmidu exprimujúceho hybridný proteín, ktorý pozostáva z lineárneho proinzulínu a fragmentu proteínového fragmentu Astaphylococcus aureus pripojeného na jeho N-koniec cez metionínový zvyšok. Kultivácia nasýtenej biomasy buniek rekombinantného kmeňa zaisťuje začiatok produkcie hybridného proteínu, ktorého izolácia a následná transformácia intubáciou vedie k inzulínu. Ďalšia skupina výskumníkov dostala v bakteriálnom expresnom systéme fúzny rekombinantný proteín pozostávajúci z ľudského proinzulínu a polyhistidínového chvosta pripojeného k nemu cez metionínový zvyšok. Bol izolovaný použitím chelátovej chromatografie na Ni-agarózových kolónach z inklúznych teliesok a štiepený bromidom kyanogénu. Autori zistili, že izolovaný proteín je S-sulfidovaný. Mapová a hmotnostná spektrometrická analýza získaného proinzulínu, vyčistená iontomeničovou chromatografiou na anexe a RP (reverzná fáza) HPLC (vysokoúčinná kvapalinová chromatografia), preukázala prítomnosť disulfidových mostíkov zodpovedajúcich disulfidovým mostíkom natívneho ľudského proinzulínu. Taktiež informoval o vývoji novej zdokonalenej metódy na získanie ľudského inzulínu metódami genetického inžinierstva v prokaryotických bunkách. Autori zistili, že inzulín získaný vo svojej štruktúre a biologickej aktivite je identický s hormonom izolovaným z pankreasu [5].

Nedávno sa pozornosť venovala zjednodušeniu postupu výroby rekombinantného inzulínu metódami genetického inžinierstva. Takže fúzny proteín pozostávajúci z vedúceho peptidu interleukínu viazaného na N-koniec proinzulínu bol získaný cez lyzínový zvyšok. Proteín bol účinne exprimovaný a lokalizovaný v inklúznych telách. Po izolácii sa proteín štiepil trypsínom za vzniku inzulínu a C-peptidu. Ďalšia skupina výskumníkov konala podobným spôsobom. Fúzny proteín pozostávajúci z proinzulínu a dvoch syntetických domén Staphylococcus proteinu A, ktoré viažu IgG, bol lokalizovaný v inklúznych telách, ale mal vyššiu úroveň expresie. Proteín bol izolovaný afinitnou chromatografiou s použitím IgG a ošetrený trypsínom a karboxypeptidázou B. Výsledný inzulín a C-peptid boli purifikované RP-HPLC. Pri vytváraní fúznych štruktúr je hmotnostný pomer nosičového proteínu k cieľovému polypeptidu veľmi významný. Takto je opísaná konštrukcia fúznych konštruktov, kde bol ako nosný polypeptid použitý proteín, ktorý viaže ľudský sérový albumín. Do neho boli pripojené jeden, tri a sedem C-peptidov. C-peptidy boli kombinované na báze chvosta s použitím aminokyselinových dištančných činidiel nesúcich reštrikčné miesto Sfi I a dva arginínové zvyšky na začiatku a na konci distančného média na následné štiepenie proteínu trypsínom. HPLC produkty štiepenia ukázali, že C-peptid sa kvantitatívne štiepi a to umožňuje použitie spôsobu multimérnych syntetických génov na produkciu cieľových polypeptidov v priemyselnom meradle.

Získanie mutovaného proinzulínu, ktoré obsahovalo nahradenie Arg32Tyr. Pri štiepení tohto proteínu kĺbom s trypsínom a karboxypeptidázou B sa vytvoril natívny inzulín a C-peptid obsahujúci tyrozínový zvyšok. Ten sa po značkovaní 125I aktívne používa v rádioimunoanalýze [6].

Kontrola kvality inzulínu

Obsah

1. Všeobecné informácie o podávaní inzulínu 5

2. Metódy používané na kontrolu kvality inzulínu 8

Odkazy 17

Výňatok z práce

1-2% európskej populácie trpí cukrovkou a asi 20% týchto pacientov nemôže existovať bez inzulínových injekcií. Od prvých pokusov o používaní inzulínu na liečbu cukrovky v roku 1922 bol tento hormón izolovaný zo slinivky bravčových buniek (kravy a ošípané). Zvierací inzulín je mierne odlišný v aminokyselinovej sekvencii od ľudského inzulínu.

Ľudské a ošípané inzulíny sú obzvlášť blízke: u prasačeného inzulínu je C-terminálny treonín B-reťazca nahradený alanínom. Krava a ľudský inzulín sa líšia v troch aminokyselinových zvyškoch. Tieto rozdiely určovali zvýšenú imunogénnu aktivitu hovädzieho inzulínu v porovnaní s inzulínom ošípaných.

Takmer všetci pacienti, ktorí boli liečení kravským inzulínom, mali protilátky proti inzulínu v krvi. Antigénne vlastnosti inzulínu boli tiež čiastočne určené nečistotami vo svojich prípravkoch. S najväčšou pravdepodobnosťou ide o tvorbu protilátok proti inzulínu, ktoré vysvetľujú niektoré vedľajšie účinky pri injekčnom podávaní inzulínu z hovädzieho dobytka, napríklad atrofia subkutánneho tuku v mieste opätovného podania injekcie. V prípade vysoko purifikovaného inzulínu tieto účinky chýbali.

Následne sa vďaka genetickému inžinierstvu a použitím E. coli získaval ľudský inzulín.

Ľudský inzulín, získaný z E. coli, bol prvým "geneticky upraveným" proteínom testovaným na ľuďoch. V experimentoch so zdravými dobrovoľníkmi sa zistilo, že je bezpečné (nespôsobuje alergické a iné nežiaduce reakcie) a má schopnosť znížiť hladinu glukózy v krvi pri podaní pod kožu alebo intravenózne.

V súčasnosti je takýto ľudský inzulín získaný mnohými diabetikov na celom svete. Predchádza to klinické skúšky, v ktorých boli študované metabolické zmeny a imunologické účinky.

Dôležitosť našej témy spočíva v tom, že nekontrolovaná alebo slabo kontrolovaná produkcia môže viesť k uvoľneniu kontaminovaných inzulínových prípravkov, čo môže viesť k nepriaznivým klinickým následkom.

Cieľom práce je študovať metódy používané pri kontrole kvality inzulínu.

Referencie

GOST R 52249-2004 "Pravidlá výroby a kontroly kvality liekov" 2004

OFS 42-0002-00 "Bakteriálne endotoxíny" 2000

OFS 42-0126-09 "Biologické testovanie inzulínu"

Farmakologický článok Ruskej federácie FS 42-2620-97. 1997

Bairamashvili D.I. Genetické inžinierstvo ľudského inzulínu: úspechy a vyhliadky // Ruský chemický časopis. - 2005. - T. XLIX. - № 1. - str. 34-45.

Goncharenko G.G. Základy biotechnológie: Metóda výučby. komplex pre stud.biolog. špec. / G.G. Goncharenko, A.V. Kruk, E.M. Stepanova, A.A. Surkov, S.A. Zyatkov; Min. ARR. RB. - Gomel: EI "GGU im.F. Skaryna, 2008. - 282 strán.

Ryabko, Yu S., Lukin, OV, Shepel, E.N. Použitie kineticko-chromogénnej metódy na stanovenie bakteriálneho endotoxínu (test LAL) v technológii čistenia geneticky upraveného ľudského inzulínu // Biopharmaceutical journal - 2009. - zv. - №1. - str. 34-37.